蓝氏贾第虫贾第素α-18和α-12基因的克

发布时间：2017-09-12 15:05

  本文关键词：蓝氏贾第虫贾第素α-18和α-12基因的克隆、原核表达及其亚细胞定位

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【摘要】：蓝氏贾第虫是一种寄生于人和多种哺乳动物肠道内的原虫,可引起以腹泻为主的贾第虫病。该虫具有高度发达的细胞骨架系统,由微管、微丝和细胞骨架蛋白所构成。研究证实,贾第虫的细胞骨架蛋白与其感染和致病有着密切关系。在参与细胞骨架构成的众多蛋白质中,贾第素是其重要组成之一。贾第素的研究不仅有助于深入了解其致病机制,而且还可将其作为抗贾第虫药物的靶位。因此,本研究对贾第素α-18和α-12基因分别进行克隆、表达及亚细胞定位分析。1.贾第素α-18基因的克隆、原核表达及其亚细胞定位。根据GenBank上参考序列设计引物,分别以贾第虫A和F型基因组DNA为模板,PCR扩增贾第素α-18编码基因序列,分别亚克隆到pMD-18T载体,测序后利用相关软件对其进行生物信息学分析;然后构建pET28a-A(human)-AG-18(人源)和pET28a-F(cat)-AG-18(猫源)原核表达载体,将其转化大肠杆菌Rosseta(DE3),对其诱导表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白;用纯化的人源贾第素α-18融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,然后采用间接免疫荧光法研究其在贾第虫滋养体的亚细胞定位情况。结果显示贾第素α-18基因全长为861 bp,人源与犬源A型贾第虫同源性为100%,A型与F型同源性为86.8%;生物信息学分析表明,贾第素α-18为疏水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,含有11个α螺旋区,13个β折叠区,1个β转角区和7个无规则卷曲;SDS-PAGE及Western-blot分析显示贾第素α-18融合蛋白相对分子质量约为36 kDa,且反应原性良好;获得的可溶性蛋白浓度分别为1.18 mg/mL和1.5 mg/mL;制备的抗血清效价高达1:25600以上,细胞定位显示其主要分布于滋养体的四对鞭毛,表明贾第素α-18是一种与鞭毛相关的蛋白。上述信息为贾第素α-18的功能研究奠定了基础。2.贾第素α-12基因的克隆、原核表达及其亚细胞定位。根据GenBank上参考序列设计特异性引物,以贾第虫A型基因组DNA为模板,PCR扩增贾第素α-12编码基因序列,亚克隆到pMD-18T载体,测序后利用相关软件对其进行生物信息学分析;然后构建pET28a-AG-12原核表达载体,将其转化大肠杆菌,对其诱导表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白;用纯化的人源贾第素α-12融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体;然后采用间接免疫荧光法研究其在滋养体的亚细胞定位情况。结果显示贾第素α-12基因序列长为972 bp,编码323个氨基酸,与参考基因序列(XM_001708393)同源性达100%;生物信息学分析表明,贾第素α-12为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,含有5个α螺旋区,1个β折叠区,4个β转角区和4个无规则卷曲;SDS-PAGE及Western-blot分析显示贾第素α-12融合蛋白相对分子质量约为40 kDa,且反应原性良好,获得的可溶性蛋白浓度为0.86 mg/mL;制备的抗血清效价高达1:25600以上,细胞定位显示其主要分布于滋养体的细胞质,表明贾第素α-12是一种与胞质相关的蛋白。上述信息为贾第素α-12的功能研究奠定了基础。
【关键词】：蓝氏贾第虫 贾第素α-18 贾第素α-12 原核表达 纯化 亚细胞定位
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文缩写对照表8-14
• 1 前言14-17
• 2 材料与方法17-41
• 2.1 材料17-23
• 2.1.1 样品17
• 2.1.2 实验动物17
• 2.1.3 菌种17
• 2.1.4 载体17-18
• 2.1.5 酶和试剂18
• 2.1.6 主要仪器18-19
• 2.1.7 培养基和常用溶液的配置19-23
• 2.2 方法23-41
• 2.2.1 蓝氏贾第虫贾第素 α-18 的原核表达及其亚细胞定位23-37
• 2.2.1.1 A型蓝氏贾第虫滋养体的培养23
• 2.2.1.2 基因组DNA提取23-24
• 2.2.1.3 引物设计24
• 2.2.1.4 贾第素 α-18 基因扩增24-25
• 2.2.1.5 PCR产物检测25
• 2.2.1.6 PCR产物回收与纯化25-26
• 2.2.1.7 PCR纯化产物的连接26-27
• 2.2.1.8 连接产物转化E.coli DH5α27
• 2.2.1.9 阳性克隆的筛选与PCR鉴定27
• 2.2.1.10 阳性克隆质粒的抽提27-28
• 2.2.1.11 阳性克隆序列的测定及分析28
• 2.2.1.12 贾第素 α-18 的生物信息学分析28-29
• 2.2.1.13 目的基因片段粘性末端的制备29
• 2.2.1.14 表达载体质粒p ET-28a(+) 的线性化29-30
• 2.2.1.15 目的基因与线性化p ET-28a(+) 的连接30
• 2.2.1.16 重组连接体系的转化30-31
• 2.2.1.17 重组表达质粒的双酶切鉴定31
• 2.2.1.18 贾第素 α-18 基因的原核表达31-32
• 2.2.1.19 表达产物的SDS-PAGE分析32-33
• 2.2.1.20 表达产物的Western blot检测33
• 2.2.1.21 目的蛋白的纯化33-34
• 2.2.1.22 纯化蛋白浓度的检测34-35
• 2.2.1.23 贾第素 α-18 多克隆抗体的制备35
• 2.2.1.24 免疫血清效价的测定35-36
• 2.2.1.25 抗血清的特异性鉴定36
• 2.2.1.26 贾第素 α-18 在贾第虫滋养体内的亚细胞定位36-37
• 2.2.2 蓝氏贾第虫贾第素 α-12 的原核表达及其亚细胞定位37-41
• 2.2.2.1 引物设计37
• 2.2.2.2 贾第素 α-12 基因扩增37-38
• 2.2.2.3 PCR产物检测38
• 2.2.2.4 PCR产物回收与纯化38
• 2.2.2.5 PCR纯化产物的连接38
• 2.2.2.6 连接产物转化E.coli DH5α38
• 2.2.2.7 阳性克隆的筛选与PCR鉴定38-39
• 2.2.2.8 阳性克隆质粒的抽提39
• 2.2.2.9 阳性克隆质粒的测序39
• 2.2.2.10 贾第素 α-12 的生物信息学分析39
• 2.2.2.11 目的基因片段粘性末端的制备39
• 2.2.2.12 目的基因与线性化载体p ET-28a(+) 的连接39
• 2.2.2.13 重组连接体系的转化39
• 2.2.2.14 重组表达质粒的双酶切鉴定39-40
• 2.2.2.15 贾第素 α-12 基因的原核表达40
• 2.2.2.16 表达产物的SDS-PAGE分析40
• 2.2.2.17 表达产物的Western blot检测40
• 2.2.2.18 目的蛋白的纯化40
• 2.2.2.19 纯化蛋白浓度的检测40
• 2.2.2.20 贾第素 α-12 多克隆抗体的制备40
• 2.2.2.21 抗血清效价的测定40
• 2.2.2.22 抗血清的特异性鉴定40
• 2.2.2.23 贾第素 α-12 在贾第虫滋养体内的亚细胞定位40-41
• 3 结果与分析41-57
• 3.1 贾第素 α-18 的原核表达及其亚细胞定位41-51
• 3.1.1 PCR产物扩增结果41
• 3.1.2 阳性克隆PCR鉴定结果41-42
• 3.1.3 目的基因测序结果及序列同源性比对分析42-44
• 3.1.4 贾第素 α-18 的生物信息学分析44-46
• 3.1.5 重组表达质粒的鉴定46-47
• 3.1.6 表达产物SDS-PAGE分析47-48
• 3.1.7 表达产物Western-blot分析48
• 3.1.8 重组蛋白的纯化48-49
• 3.1.9 抗血清效价的测定49-50
• 3.1.10 抗血清特异性分析50
• 3.1.11 贾第素 α-18 在贾第虫滋养体的亚细胞定位50-51
• 3.2 贾第虫贾第素 α-12 的原核表达及其亚细胞定位51-57
• 3.2.1 贾第素 α-12 基因的扩增结果51-52
• 3.2.2 阳性克隆PCR鉴定结果52
• 3.2.3 基因序列的测定及生物信息学分析52-54
• 3.2.4 重组表达质粒的鉴定54
• 3.2.5 表达产物的SDS-PAGE分析54-55
• 3.2.6 表达产物的Western-blot分析55
• 3.2.7 重组蛋白的纯化55
• 3.2.8 抗血清效价的测定55-56
• 3.2.9 抗血清特异性分析56
• 3.2.10 贾第素 α-12 在贾第虫滋养体的亚细胞定位56-57
• 4 讨论57-63
• 4.1 不同宿主贾第虫A型和F型贾第素 α-18 基因的遗传变异57-58
• 4.2 贾第虫贾第素 α-18 的原核表达及其亚细胞定位58-60
• 4.3 贾第虫贾第素 α-12 的原核表达及其亚细胞定位60-63
• 全文总结63-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-70
• 附录：攻读硕士学位期间论文发表、学术会议及获奖情况70-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 武省;李国清;;蓝氏贾第虫致病机制的研究进展[J];中国动物传染病学报;2015年01期

2 王洋;王沂;杨文思;李冀;余源;沈海娥;刘青;田喜凤;;蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素特异性多克隆抗体的制备及免疫电镜定位研究[J];中国病原生物学杂志;2012年12期

3 王中全,崔晶;贾第虫病流行病学研究进展[J];国外医学(寄生虫病分册);2005年03期

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本文编号：837904