狂犬病病毒样颗粒免疫原的制备与实验免疫研究

发布时间：2017-09-12 19:06

  本文关键词：狂犬病病毒样颗粒免疫原的制备与实验免疫研究

  更多相关文章： 狂犬病 双抗体夹心ELISA 狂犬病病毒样颗粒 免疫原性

【摘要】：狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的侵害中枢神经系统的致死性人兽共患传染病,发病后几乎100%死亡,至今仍无特效治疗药物。据世界卫生组织统计,全世界每年至少六万人死于狂犬病,大多数的病例发生于非洲和亚洲。狂犬病主要通过被患狂犬病的病犬抓、咬伤所传播,因此从源头上控制动物的狂犬病是消灭人狂犬病的根本。对家养犬、猫和野生动物等进行有效的狂犬病疫苗免疫降低其感染几率,是控制动物狂犬病的最主要举措。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)为不含核酸的病毒空壳结构,由病毒衣壳蛋白或者由衣壳蛋白和囊膜蛋白在体外自主装配组成的一种颗粒。VLPs保留了天然病毒的形态和结构,同时还可以模拟天然病毒对宿主的感染,可刺激机体同时产生细胞免疫和体液免疫。此外,由于VLPs不含有核酸,无感染和复制能力。VLPs作为免疫原制备新型疫苗已显示出免疫原性强和安全性好等优点,是具有良好前景和应用开发潜力的候选疫苗。RABV糖蛋白(Glycoprotein,GP)为唯一诱导并刺激机体产生病毒中和抗体的结构蛋白,基质蛋白(Matrix protein,MP)是维持病毒形态的结构蛋白,还决定了RABV的合成、出芽,且MP上具有GP专一性结合位点,同时也会对GP在病毒包膜表面的结构形态造成影响。鞭毛蛋白(flagellin)是Toll样受体5(toll-like receptor,TLR5)天然激动剂,可刺激B细胞和T细胞参与适应性免疫,诱导高效的天然免疫。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)与神经节苷脂GM1高度亲和,增强抗原提呈能力,诱导淋巴细胞增殖与分化,提高机体免疫应答。GP和MP是构建RABV-VLP的基本组成蛋白,flagellin和LTB则可作为狂犬病病毒VLP膜锚定形式的分子佐剂。本研究将构建的分别表达狂犬病病毒结构蛋白和Flagellin、LTB等因子的重组杆状病毒共同感染昆虫细胞,制备了两种嵌合型狂犬病VLPs,同时对其免疫原性进行了评价。此外,本研究还建立了可特异性检测狂犬病病毒糖蛋白含量的双抗体夹心ELISA检测方法。第一章:双抗体夹心ELISA定量检测狂犬病病毒糖蛋白检测方法的建立及初步应用。以狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,犬抗狂犬病病毒多克隆抗体作为检测抗体,以半数细胞感染量(TCID50)准确定量的狂犬病病毒SRV9毒株病毒液为标准品,建立了检测狂犬病病毒糖蛋白(RABV-GP)含量的双抗体夹心ELISA定量检测方法,通过优化反应条件后,对其特异性、重复性和灵敏度进行分析。结果显示,双抗体夹心ELISA定量检测方法最佳工作条件为:狂犬病病毒糖蛋白蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,100μL/孔,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭120min;犬抗狂犬病病毒多克隆抗体1:200稀释,37℃孵育90min;酶标二抗1:5000稀释,37℃孵育60min;TMB室温避光显色30min。该方法可特异性定量检测狂犬病病毒,与犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬传染性肝炎病毒均不发生反应。该方法线性检测范围为1×104~1.0×107TCID50/mL,平均批内变异系数小于6%,平均批间变异系数均小于8%。第二章:嵌合型狂犬病病毒病毒样颗粒免疫原的制备与鉴定。将表达RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株GP和MP的重组杆状病毒、含GP跨膜区和胞质尾区的flagellin和LTB融合基因的重组杆状病毒进行体外传代培养,并分别将表达GP、MP和flagellin或LTB的三种重组杆状病毒共感染悬浮培养的Sf9细胞,27℃培养4~5d,离心收集细胞上清液。电镜观察可见大小约在180~200 nm、纤突明显的圆形或椭圆形RABV-VLP,Western Blot结果表明两种嵌合型RABV-VLP的四种组成蛋白GP、MP和flagellin或LTB均成功表达。经ELISA检测表明:两种嵌合型RABV-VLP的糖蛋白含量相当于细胞培养的天然狂犬病病毒糖蛋白含量。数据表明:利用悬浮培养昆虫细胞成功组装了可同时表达Flagellin或LTB的两种嵌合型狂犬病病毒病毒样颗粒EVLP-F和EVLP-L。第三章:嵌合型狂犬病病毒病毒样颗粒免疫原的实验免疫研究。分别将表达GP、MP和flagellin或LTB的三种重组杆状病毒共感染悬浮培养的Sf9细胞,27℃培养4~5d,收获细胞混合物进行高压爆破处理后离心收取上清。将收集的细胞上清分别辅以铝胶、多糖佐剂和弗氏佐剂制备狂犬病病毒样颗粒疫苗。分别通过肌肉注射方式免疫小鼠和犬,首次免疫间隔两周后加强免疫一次,对EVLP-F和EVLP-L的免疫效果进行评价。小鼠免疫实验结果显示,首次免疫后两周,免疫小鼠血清内均可检测到狂犬病病毒中和抗体(Virus neutralization antibody,VNA),且EVLP-L免疫组小鼠VNA滴度高于EVLP-F免疫组,铝胶佐剂免疫组VNA滴度高于多糖佐剂组和弗氏佐剂组。加强免疫后,免疫小鼠VNA滴度均获得显著提高,最高抗体效价可到23.38IU/mL。犬免疫实验结果显示,免疫后一周,免疫犬体内即可产生VNA,且EVLP-L免疫组VNA滴度高于EVLP-F免疫组,铝胶佐剂免疫组VNA滴度高于多糖佐剂组。加强免疫后,免疫犬VNA滴度均获得显著提高,最高抗体效价可到53.30IU/mL。数据表明:两种嵌合型RABV-VLP均具有良好的免疫原性,免疫后可刺激机体产生高滴度的狂犬病病毒中和抗体,具有发展成为高效、低成本新型狂犬病疫苗的良好前景。
【关键词】：狂犬病 双抗体夹心ELISA 狂犬病病毒样颗粒 免疫原性
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-11
• 第一篇 文献综述11-16
• 1.1 狂犬病概述11-13
• 1.2 病毒样颗粒研究进展13-14
• 1.3 鞭毛蛋白及大肠杆菌不耐热肠毒素的佐剂效应研究进展14-15
• 1.4 狂犬病病毒定量检测方法概述15-16
• 第二篇 研究内容16-46
• 第一章 狂犬病病毒糖蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用16-26
• 1.1 材料16-18
• 1.2 方法18-21
• 1.3 结果21-24
• 1.4 讨论24-25
• 1.5 小结25-26
• 第二章 嵌合狂犬病病毒样颗粒的制备与鉴定26-37
• 2.1 材料26-28
• 2.2 方法28-32
• 2.3 结果32-35
• 2.4 讨论35-36
• 2.5 小结36-37
• 第三章 嵌合狂犬病病毒样颗粒实验免疫研究37-46
• 3.1 材料37-38
• 3.2 方法38-41
• 3.3 结果41-44
• 3.4 讨论44
• 3.5 小结44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• 附录52-54
• 作者简介54-55
• 致谢55-56

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 樊茂华,徐东萍;狂犬病的防治[J];湖北畜牧兽医;2004年04期

2 赵云蛟,钱爱东,李公美,姚纪元;狂犬病病毒分子流行病学研究进展[J];经济动物学报;2004年03期

3 林松;没被狗咬也能感染狂犬病[J];农村新技术;2004年10期

4 陆立权;郭建刚;刘棋;李华明;熊毅;郑敏;邹联斌;兰彬;苏凯;;外观健康家犬携带狂犬病病毒状况调查[J];广西农业科学;2006年01期

5 唐婕;金亮;李六金;;老病新谈人兽共患狂犬病[J];动物保健;2006年02期

6 林家全;;常见动物疫病的诊治(4) 狂犬病[J];湖南农业;2006年04期

7 刘涛;王瑞;;狂犬病的流行现状及防治思考[J];现代畜牧兽医;2006年05期

8 高集云;;狂犬病离我们有多远?[J];动物保健;2006年08期

9 张永振;;中国狂犬病的流行病学特征及防制建议[J];动物保健;2006年08期

10 涂长春;;我国狂犬病流行现状及原因[J];动物保健;2006年08期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 丁继超;张海林;章域震;杨卫红;冯云;李浩;唐青;;云南省狂犬病病毒分子流行病学研究[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

2 罗廷荣;;广西狂犬病流行现状[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

3 周鹏;徐静东;王晓娟;赵s，

本文编号：838978