副猪嗜血杆菌病重组亚单位疫苗候选抗原蛋白的免疫保护效力评价

发布时间：2017-09-14 03:25

  本文关键词：副猪嗜血杆菌病重组亚单位疫苗候选抗原蛋白的免疫保护效力评价

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【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)定殖于猪上呼吸道,为一种条件致病菌,急性感染可导致全身性疾病,感染后主要的病理表现为关节炎、肺炎、浆膜炎和脑膜炎。对我国乃至全世界养猪业造成了巨大的经济损失,是目前危害全球养猪业最严重的细菌病之一。按照琼脂扩散试验和间接血凝试验(IHA)对H.parasuis进行血清分型,H.parasuis至少可分为15个血清型,但约20%的分离株无法分型。目前,市场上还没有一种疫苗对所有血清型的H.parasuis感染都能产生有效的免疫保护作用。H.parasuis的一些分泌蛋白和外膜蛋白被认为是有效的保护性抗原,有作为有效疫苗的候选抗原的潜力。最近,本实验室通过蛋白质组学技术从H.parasuis血清5型参考菌株Nagasaki中筛选到7个分泌蛋白(CdtB,CdtC,AfuA,HbpA,OppA,HktE,HPS-04307),为了评价上述7个蛋白用于制备重组亚单位疫苗的潜力,本研究将cdtB和cdtC基因进行了克隆(另5个蛋白的重组载体已由本实验室构建完成),并以His融合蛋白的形式进行了表达和纯化。初期以各蛋白对小鼠进行免疫攻毒试验,从中筛选到5个保护作用较好的重组蛋白(rCdtB,rCdtC,rAfuA,rOppA,rHPS-04307),并再次以小鼠模型评价了这5个蛋白混合后的免疫保护效力。在小鼠模型中,所有蛋白都能诱导机体产生体液免疫反应并对血清5型HN10菌株和13型ZD12菌株的H.parasuis攻毒产生不同程度的免疫保护作用,5个蛋白混合后对小鼠的保护率最高(对H.parasuis血清5型HN10和13型ZD12菌株的免疫保护率分别为85%和60%)。此外,全血杀菌实验结果表明各蛋白的抗血清能够有效地抑制H.parasuis的生长,淋巴细胞增殖试验结果表明各蛋白能够显著刺激小鼠T淋巴细胞增殖。本研究表明rCdtB,rCdtC,rAfuA,rOppA,rHPS-04307能够对致死剂量的H.parasuis血清5型HN10和13型ZD12感染产生有效的免疫保护作用,为新一代多组分疫苗的研制提供了重要参考。
【关键词】：副猪嗜血杆菌 抗原筛选 亚单位疫苗 免疫保护
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-7
• abstract7-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-22
• 1.1 副猪嗜血杆菌研究概述11-17
• 1.1.1 病原学11-12
• 1.1.2 病理学12
• 1.1.3 致病机理12-13
• 1.1.4 血清型13-14
• 1.1.5 流行病学14
• 1.1.6 副猪嗜血杆菌病的诊断与防治14-17
• 1.2 副猪嗜血杆菌病疫苗研制进展17-19
• 1.3 重组亚单位疫苗候选抗原蛋白研究进展19-20
• 1.4 研究的目的和意义20-22
• 第二章 副猪嗜血杆菌抗原蛋白的制备22-26
• 2.1 材料22
• 2.1.1 菌株和质粒22
• 2.1.2 主要试剂和仪器设备22
• 2.2 方法22-24
• 2.2.1 H.parasuis血清5型Nagasaki参考菌株基因组的提取22-23
• 2.2.2 目的基因的PCR扩增23
• 2.2.3 重组质粒的构建与鉴定23-24
• 2.2.4 重组蛋白的表达、纯化及鉴定24
• 2.3 结果24-26
• 2.3.1 目的基因的PCR扩增24-25
• 2.3.2 重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定25-26
• 第三章 副猪嗜血杆菌重组蛋白免疫效果评价26-37
• 3.1 材料26
• 3.1.1 菌株及实验动物26
• 3.1.2 主要试剂和仪器设备26
• 3.2 方法26-30
• 3.2.1 半数致死剂量（LD50）的测定26-27
• 3.2.2 小鼠免疫攻毒试验27
• 3.2.3 血清抗体的检测27-28
• 3.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT法）28
• 3.2.5 细胞因子的检测28-29
• 3.2.6 小鼠肝脏载菌量检测试验29-30
• 3.2.7 全血杀菌试验30
• 3.3 结果30-35
• 3.3.1 H. parasuis LD50的测定结果30
• 3.3.2 小鼠免疫、攻毒试验结果30-31
• 3.3.3 血清抗体检测结果31-32
• 3.3.4 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖试验结果32-33
• 3.3.5 细胞因子检测结果33
• 3.3.6 小鼠肝脏载菌量试验结果33-34
• 3.3.7 全血杀菌试验结果34-35
• 3.4 讨论35-37
• 第四章 全文结论37-38
• 参考文献38-46
• 致谢46-47
• 作者简介47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 蔡旭旺,刘正飞,陈焕春,吴斌,金梅林,Pat Blackall;副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J];华中农业大学学报;2005年01期

2 蔡旭旺,陈焕春,吴斌,刘正飞;副猪嗜血杆菌病的危害与防治[J];养殖与饲料;2003年05期

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本文编号：847593