草酸钙对体外培养犬肾小管上皮细胞的作用

发布时间：2017-09-14 02:32

  本文关键词：草酸钙对体外培养犬肾小管上皮细胞的作用

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【摘要】：尿石症是犬猫常见的泌尿道疾病。近20年来,犬草酸钙尿结石的发病率已超过了磷酸铵镁结石成为最常见的犬尿结石病类型。其成因多样,与饮食和品种均有关系。随着对人类草酸钙尿结石的研究不断深入,研究人员在草酸钙尿结石成因的研究方面出现了大量理论和实践成果。本论文根据已被广泛认同的草酸钙结石形成理论:结石形成需要经过矿物成核、生长、聚集、矿物与肾小管上皮细胞的粘附四个过程,设计了本实验,以探讨犬草酸钙尿结石形成过程中草酸钙对犬肾小管上皮细胞的作用。本研究通过体外传代培养犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞),在细胞培养液中加入终浓度分别为300μg/mL、600μg/mL、900μg/mL的草酸钙,各自培养1h、2h、6h、12h、24h、48h,用显微镜观察各作用时间下细胞在培养皿里的贴壁情况、细胞形态学变化和草酸钙结晶在细胞内外的粘附和聚集情况;然后将各时间段各浓度相应细胞样本收集起来进行超声破碎,通过CCK-8法测定细胞活性;用试剂盒测定MDCK细胞内蛋白含量、过氧化氢含量、丙二醛含量、乳酸脱氢酶含量、γ-谷氨酰转肽酶活力和超氧化物歧化酶活力,测定细胞氧化损伤和抗氧化情况。将所得结果整理对比分析,探讨草酸钙刺激MDCK细胞后,细胞活力的变化、草酸钙结晶粘附和聚集情况以及细胞氧化损伤/抗氧化能力三者之间的关系。实验结果显示,同一浓度作用下,MDCK细胞活力和细胞SOD活性都随草酸钙作用时间延长而下降,而细胞受氧化损伤程度随实验延长而加深,草酸钙结晶在细胞内外粘附和聚集增多;在同一作用时间下,草酸钙浓度越高,MDCK细胞活力和细胞SOD活性越低,细胞受氧化损伤及草酸钙的粘附和聚集越严重。由此得到结论:草酸钙对犬肾小管上皮细胞具有细胞毒性,其中包括草酸钙能引起细胞产生有害氧自由基而发生氧化损伤。此过程中,草酸钙结晶开始粘附和聚集,而且随着细胞损伤加剧和细胞碎片增多,结晶粘附和聚集更快更多。因此,草酸钙在犬尿液中浓度越高,含草酸钙尿液在肾脏中时间越长,越容易导致犬肾脏出现损伤并加剧草酸钙结晶粘附,促进犬草酸钙结石形成。
【关键词】：草酸钙 MDCK细胞 结晶粘附 细胞活力 氧化损伤
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1．前言9-16
• 1.1 结晶与细胞粘附的影响因素10-11
• 1.1.1 结晶与细胞粘附的作用模式10
• 1.1.2 肾小管上皮细胞损伤对结晶细胞粘附的影响10-11
• 1.1.3 前列腺素对细胞结晶粘附的影响11
• 1.1.4 基质对细胞结晶粘附的影响11
• 1.2 细胞膜损伤诱导草酸钙结石的形成机制11-12
• 1.2.1 细胞膜磷脂失去不对称性11-12
• 1.2.2 引起肾小管细胞表面表达透明质酸12
• 1.3 细胞损伤诱导草酸钙结晶粘附实验12-14
• 1.3.1 细胞损伤后的结果12-13
• 1.3.2 线粒体介导细胞凋亡13
• 1.3.3 尿激酶抑制结石的机理13-14
• 1.4 肾小管上皮细胞氧化损伤模型的建立14
• 1.4.1 HKC氧化损伤模型的建立14
• 1.4.2 Vero氧化损伤模型的建立14
• 1.5 草酸和草酸钙造成MDCK的损伤14-16
• 1.5.1 MDCK细胞系介绍14-15
• 1.5.2 不同浓度草酸和草酸钙对MDCK的损伤差异15
• 1.5.3 草酸钙结晶在MDCK上聚积及对肾脏的影响15-16
• 2 材料与方法16-26
• 2.1 细胞株16
• 2.2 试验药物、试剂及仪器16-17
• 2.2.1 试验药物及主要试剂16
• 2.2.2 主要试剂的配制16
• 2.2.3 主要试验仪器与器材16-17
• 2.3 细胞培养17-18
• 2.3.1 MDCK细胞的复苏17
• 2.3.2 MDCK细胞的传代17-18
• 2.3.3 细胞计数18
• 2.4 试验分组18-19
• 2.4.1 细胞活性检测试验18
• 2.4.2 细胞损伤检测试验18-19
• 2.5 不同浓度草酸钙和不同作用时间对细胞活力的影响19-20
• 2.5.1 CCK-8 法原理19
• 2.5.2 细胞生长曲线的测定19
• 2.5.3 细胞活力的测定19-20
• 2.6 不同浓度草酸钙和不同作用时间对细胞损伤的影响20-26
• 2.6.1 草酸钙刺激细胞20
• 2.6.2 显微镜下观察细胞变化20
• 2.6.3 细胞样本前处理20-21
• 2.6.4 细胞蛋白定量测定（TP）21
• 2.6.5 细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性测定21-22
• 2.6.6 细胞微量丙二醛（MDA）测定22-23
• 2.6.7 细胞过氧化氢（H_2O_2）的测定23-24
• 2.6.8 细胞乳酸脱氢酶（LDH）含量测定24-25
• 2.6.9 细胞 γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT/GGT）活力的测定25-26
• 2.7 数据处理26
• 3.结果26-47
• 3.1 不同浓度草酸钙和不同作用时间对细胞形态学的影响26-40
• 3.1.1 草酸钙对MDCK细胞生长状态的影响26-33
• 3.1.2 草酸钙在细胞表面附着和聚积情况33-40
• 3.2 不同浓度草酸钙和不同作用时间影响MDCK细胞活力的测定结果40-42
• 3.2.1 MDCK细胞生长曲线40-41
• 3.2.2 草酸钙对 MDCK 细胞活力的影响41-42
• 3.3 不同浓度草酸钙和不同作用时间细胞损伤的测定42-47
• 3.3.1 草酸钙对细胞蛋白含量的影响42-43
• 3.3.2 草酸钙对细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响43-44
• 3.3.3 草酸钙对细胞中丙二醛（MDA）含量的影响44-45
• 3.3.4 草酸钙对细胞中过氧化氢(H_2O_2)含量的影响45-46
• 3.3.5 草酸钙对细胞中乳酸脱氢酶（LDH）含量的影响46-47
• 3.3.6 草酸钙对细胞中 γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT/GGT）活力的影响47
• 4 分析与讨论47-54
• 4.1 草酸钙对细胞的毒性47-49
• 4.2 草酸钙对MDCK细胞活力的影响49-51
• 4.3 草酸钙在MDCK细胞内外的聚集51-52
• 4.4 草酸钙对MDCK细胞造成的氧化损伤52-54
• 全文结论54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-59

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本文编号：847352