蓝舌病毒感染细胞（A.albopictus和PST）miRNA表达谱的鉴定与功能分析

发布时间：2017-09-14 08:46

  本文关键词：蓝舌病毒感染细胞（A.albopictus和PST）miRNA表达谱的鉴定与功能分析

  更多相关文章： 蓝舌病病毒 白纹伊蚊细胞 原代绵羊睾丸细胞 高通量测序 miRNA

【摘要】：蓝舌病(Bluetongue)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的以媒介昆虫库蠓为主要传播媒介的一种非接触性传染病,其易感动物为绵羊、山羊、牛和鹿等反刍动物。蓝舌病的暴发经常给家畜养殖业造成巨大经济损失,因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的动物传染病。BTV隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)。microRNA(miRNA)是大小约为19-25个核苷酸具有调控功能的一类非编码单链小RNA。近年来研究表明,miRNA在病原-媒介-宿主相互作用过程中发挥重要的调控作用,可通过调控靶基因的表达影响病毒的感染与复制,在宿主细胞的免疫调控和抗病毒反应中发挥重要作用。目前,人们对BTV与细胞相互作用的理解非常有限,细胞miRNA在BTV感染过程中的作用仍不清楚。本研究首先利用Solexa高通量测序技术对BTV感染的白纹伊蚊(Aedes albopictus,A.albopictus)细胞和原代绵羊睾丸(primary sheep testis,PST)细胞及其未感染样品进行miRNA测序,借助生物信息学技术对差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释和分析,通过实时定量PCR方法对部分差异miRNA和靶基因的表达丰度进行了验证。同时选择了三个表达差异的miRNA,对其在BTV复制过程中的作用机制进行了初步研究,结果如下:1.BTV感染A.albopictus细胞组和对照组经高通量测序获得11,206,854和12,125,274个可信序列标签,分别含89和92个已知miRNA,266和181个新预测miRNA。两组之间有15个已知miRNA和125个新miRNA发生显著差异表达。GO和KEGG分析显示靶基因主要参与内吞作用、代谢途径、FoxO、Hippo、Jak-STAT和MAPK等信号通路,表明miRNA在BTV感染媒介细胞过程中发挥广泛的调控作用。2.选取具有差异表达的aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p为靶标,将其模拟体、抑制剂及对照转染A.albopictus细胞,并利用qRT-PCR和噬斑试验分析BTV在转染细胞中的增殖效率,结果表明两种miRNA模拟体可分别上调BTV NS3基因表达1.55-2.88倍和2.00-3.22倍,且病毒滴度均增加,而miRNA抑制剂可明显分别下调BTV NS3基因的表达0.54-0.64倍和0.55-0.86倍,且病毒滴度均降低,表明aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p均可促进BTV在A.albopictus细胞中复制。3.BTV感染PST细胞组和对照组经高通量测序获得10,908,164和11,920,794个可信序列标签,分别含87和90个已知miRNA,182和155个新预测miRNA。两组之间有2个已知miRNA和70个新miRNA发生显著的差异表达。GO功能和KEGG路径分析显示差异表达miRNA的靶基因主要参与催化活性、病毒感染、内吞作用、代谢途径等信号通路,表明miRNA在BTV感染宿主细胞的多个环节同样具有潜在的调控作用。4.进而选取novel-mir-105为靶标,将其模拟体、抑制剂及对照转染PST细胞,并利用qRT-PCR和噬斑试验分析BTV在转染细胞中的增殖效率,结果表明miRNA模拟体转染组BTV NS3基因下调0.32-0.80倍,且病毒滴度降低,而miRNA抑制剂转染组BTV NS3基因上调2.09-2.41倍,且病毒滴度增加,表明novel-mir-105抑制BTV在PST细胞中复制。
【关键词】：蓝舌病病毒 白纹伊蚊细胞 原代绵羊睾丸细胞 高通量测序 miRNA
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 蓝舌病概况14-15
• 1.2 蓝舌病毒15-18
• 1.2.1 蓝舌病毒形态和基因组结构15-18
• 1.2.2 蓝舌病毒复制周期18
• 1.3 microRNA概述18-21
• 1.3.1 miRNA生物起源18-20
• 1.3.2 miRNA作用机制20
• 1.3.3 miRNA研究方法-高通量测序技术20-21
• 1.4 细胞miRNA与病原相互作用的研究21-22
• 1.5 研究目的与意义22-23
• 第二章 蓝舌病毒感染A. albopictus细胞miRNA表达谱的鉴定23-44
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 细胞与病毒23
• 2.1.2 主要实验试剂23
• 2.1.3 主要仪器设备23-24
• 2.2 实验方法24-31
• 2.2.1 细胞培养24
• 2.2.2 BTV感染A.albopictus细胞的收集和总RNA提取24-25
• 2.2.3 RT-PCR和噬斑试验25-26
• 2.2.4 高通量测序26-27
• 2.2.5 测序数据分析27-28
• 2.2.6 miRNA分析28
• 2.2.7 miRNA靶基因预测28
• 2.2.8 实时定量PCR验证miRNA及其靶基因28-31
• 2.2.9 miRNA靶基因的GO和KEGG分析31
• 2.3 结果31-43
• 2.3.1 BTV在A.albopictus细胞中的增殖特性31-33
• 2.3.2 测序数据分析33-34
• 2.3.3 已知miRNA的鉴定和差异表达分析34-36
• 2.3.4 新miRNA的预测和差异表达分析36-40
• 2.3.5 miRNA靶基因的GO及KEGG分析40-41
• 2.3.6 实时定量PCR验证miRNA及其对应靶基因41-43
• 2.4 讨论43-44
• 第三章 蓝舌病毒感染PST细胞miRNA表达谱的鉴定44-58
• 3.1 实验材料44
• 3.1.1 细胞、病毒和抗体44
• 3.1.2 主要实验试剂与仪器设备44
• 3.2 实验方法44-47
• 3.2.1 PST细胞的制备与培养44-45
• 3.2.2 细胞免疫荧光试验45
• 3.2.3 BTV感染PST细胞的收集和RNA提取45
• 3.2.4 RT-PCR和噬斑试验45
• 3.2.5 测序样品收集45-46
• 3.2.6 高通量测序46
• 3.2.7 生物信息学分析46
• 3.2.8 新miRNA和对应靶基因的预测46
• 3.2.9 miRNA差异分析46
• 3.2.10 GO功能和KEGG路径分析46-47
• 3.2.11 实时定量PCR验证mi RNA47
• 3.3 结果47-56
• 3.3.1 BTV在PST细胞中的生长增殖特性47-49
• 3.3.2 测序数据分析49-51
• 3.3.3 显著差异表达miRNA分析51-55
• 3.3.4 miRNA靶基因分析55
• 3.3.5 GO功能和KEGG路径分析55-56
• 3.3.6 实时定量PCR验证显著差异表达miRNA56
• 3.4 讨论56-58
• 第四章 蓝舌病毒感染细胞后3个细胞miRNA功能初步研究58-71
• 4.1 实验材料58
• 4.1.1 细胞与病毒58
• 4.1.2 主要实验试剂58
• 4.2 实验方法58-62
• 4.2.1 miRNA模拟体和抑制剂的设计与合成58-59
• 4.2.2 siRNA的设计与合成59-60
• 4.2.3 PST细胞转染miRNA最佳条件摸索60
• 4.2.4 A.albopictus细胞转染miRNA和siRNA最佳条件摸索60
• 4.2.5 转染实验60-61
• 4.2.6 转染样品收集及RNA提取61
• 4.2.7 实时定量PCR和噬斑试验验证miRNA和靶标基因对BTV复制的调节作用61-62
• 4.3 结果62-69
• 4.3.1 miRNA和siRNA转染实验最佳条件的确定62-64
• 4.3.2 Novel-mir-105抑制BTV在PST细胞中复制64-65
• 4.3.3 Aae-miR18895p和aae-miR29405p均促进BTV在A.albopictus细胞中复制65-68
• 4.3.4 靶标基因AAEL012723和AAEL018190表达量下调抑制BTV在A.albopictus细胞中复制68-69
• 4.4 讨论69-71
• 第五章 全文结论71-72
• 参考文献72-79
• 致谢79-80
• 作者简历80

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本文编号：849052