鸡马立克氏病病毒中国分离毒株分子进化研究

发布时间：2017-09-14 20:17

  本文关键词：鸡马立克氏病病毒中国分离毒株分子进化研究

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【摘要】：鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒1型(MDV-1)引起的一种严重危害养禽业的传染性淋巴组织增生性疾病。主要临床症状表现为T淋巴细胞瘤和神经麻痹。其病原MDV-1又称禽疱疹病毒2型,属于疱疹病毒科,马立克病毒属。该病在疫苗的广泛使用下得到了有效的控制,但近些年来MD流行病学调查显示,中国免疫鸡群中MD发生比例呈明显上升趋势。分离毒株的毒力研究也证明,新分离毒株致病特征发生变化,病毒毒力明显增强。在MDV毒力不断增强,现有MD疫苗不能提供完全保护的情况下,研究MDV分离毒株分子进化规律和趋势,寻找分离毒株毒力相关因子,是目前防控MD的前提。之前对中国MDV分离毒株分子进化的研究主要集中于少数几个基因,对于MDV这样的大基因组病毒,难以反映其真实分子进化规律。而完成全基因组测序的中国分离毒株仅仅包括了814、LMS和GX0101 3株毒株。这些数据不能够充分揭示中国MDV分离毒株的分子进化以及探究分离毒株毒力相关因子。本研究中我们选取6株在2011-2014年分离的中国MDV毒株LCC、LTS、WC/1203、JL/1404、CC/1409和HS/1412株以及1株1974年分离的中国毒株J-1株,进行病毒基因组高通量测序和序列比对分析。基因组组装结果显示7株测序毒株基因组大小相似,在176kbp左右,基因组结构符合E类疱疹病毒基因组特点。通过基因组进化树分析,首次从基因组水平证明在过去的二十多年间中国和世界范围内的MDV已经进化;20世纪90年代是MDV进化的转折点。基因组和重要基因、片段进化树分析证明,2000年以后分离的中国毒株具有近的进化关系。经过基因组序列比对分析,证明中国分离MDV毒株包含特异性序列,尤其是在meq、ICP4、UL36基因和短独特区与末端短重复区(US/TRS)连接区域。其中,meq、ICP4、UL29基因的点突变,US/TRS连接区域151-bp插入推测更可能与中国MDV新分离毒株毒力增强有关。另外,单核苷酸突变RLORF4 T11M、RLORF7 P176R/T、UL29 R506L、RSORF1 K44 R和ICP4 K1948M是中国新分离毒株的特有突变。为了更全面的了解中国MDV分离毒株毒力相关因子,我们对中国MDV分离毒株L-MS体外传代致弱株L-MSp75和L-MSp110及其亲本毒株L-MSp5进行基因组高通量测序和序列比对分析,探究MDV毒株体外进化分子变异规律。序列比对分析证明,中国MDV分离毒株体外传代致弱株发生了大量的插入、缺失和非无义单核苷酸突变。特别是RLORF1、RLORF2、RLORF12、ICP4、US7和US8基因突变以及内部短重复区(IRS)上游(TRS下游)601-bp缺失,IRS/US(US/TRS)连接区域15bp插入、116bp缺失推测可能与中国MDV分离毒株毒力致弱有关。结合上述中国MDV分离毒株毒力增强相关分子变异结果,证明ICP4基因和US/TRS连接区域是中国MDV分离毒株毒力相关的变异富集区,是下一步MDV毒力相关分子研究的重点。本研究首次从基因组水平对中国MDV分离毒株进行了分子进化分析,并结合分离毒株体外继代致弱毒株基因组分析,探究了中国MDV分离毒株毒力相关变异。为下一步MDV毒力研究以及更好的防控MD和新型MD疫苗的研制提供了研究方向和理论基础。
【关键词】：鸡马立克氏病病毒 基因组 分子进化 毒力
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-15
• 第一章 引言15-25
• 1.1 鸡马立克氏病及鸡马立克氏病病毒15-16
• 1.2 鸡马立克氏病病毒基因组及功能基因16-19
• 1.2.1 病毒基因组16-17
• 1.2.2 病毒功能基因17-19
• 1.3 鸡马立克氏病病毒在宿主中的感染19-20
• 1.4 鸡马立克氏病流行病学20-22
• 1.4.1 鸡马立克氏病流行情况20-21
• 1.4.2 鸡马立克氏病病毒毒力演化21-22
• 1.5 鸡马立克氏病疫苗和防控22-24
• 1.6 本研究的目的和意义24-25
• 第二章 鸡马立克氏病病毒分离毒株分子进化25-44
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 病毒株25-26
• 2.1.2 SPF鸡/鸭胚26
• 2.1.3 主要试剂26
• 2.1.4 试验仪器26
• 2.2 方法26-30
• 2.2.1 病毒分离和鉴定26-27
• 2.2.2 病毒增殖27
• 2.2.3 病毒基因组提取和纯化27-28
• 2.2.4 病毒基因组高通量测序28
• 2.2.5 病毒基因组sanger法测序28
• 2.2.6 病毒基因组序列拼接28-29
• 2.2.7 病毒基因组分析29-30
• 2.3 结果30-41
• 2.3.1 病毒分离、鉴定与增殖30-31
• 2.3.2 病毒基因组提取和纯化31-32
• 2.3.3 病毒基因组组成32-33
• 2.3.4 中国MDV分离毒株遗传进化树分析33-35
• 2.3.5 中国MDV分离毒株重要基因、片段分析35-39
• 2.3.6 中国MDV新分离毒株单核苷酸多态性39-41
• 2.4 讨论41-44
• 第三章 鸡马立克氏病病毒分离毒株体外继代分子变异44-51
• 3.1 材料44
• 3.1.1 病毒株44
• 3.2 方法44-45
• 3.3 结果45-49
• 3.3.1 病毒增殖和基因组纯化45
• 3.3.2 病毒基因组组成45
• 3.3.3 传代致弱毒株包含插入突变45-46
• 3.3.4 传代致弱毒株包含缺失突变46-47
• 3.3.5 传代致弱毒株基因包含单核苷酸多态性47-49
• 3.4 讨论49-51
• 第四章 全文结论51-52
• 参考文献52-60
• 致谢60-61
• 作者简历61

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本文编号：852111