F2代抗PCV2转基因猪的抗病力分析
发布时间：2017-09-15 10:33
本文关键词：F2代抗PCV2转基因猪的抗病力分析
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【摘要】：猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)在分类学上为圆环病毒科圆环病毒属,是迄今为止发现的最小动物病毒之一。它含有共价闭合的单股环状负链DNA,基因组大小约为1.76Kb。已知的PCV共有两个血清型,即PCV1和PCV2,PCV1为非致病性病毒;PCV2为多种猪常见疾病的病原,感染后导致机体免疫抑制,与其它病原体一起引起混合感染或继发感染,另外该病毒的感染具有持续性长的特点,使疾病长期存在难以根除,给养猪业造成极大的损失。目前对于该病毒的控制主要以注射PCV2疫苗和加强生产管理为主。随着分子生物学技术的发展,借助新的分子育种技术获得抗PCV2猪已成为可能。本实验室利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)结合转基因技术成功培育出F0代抗PCV2转基因猪,并且在分子水平和细胞水平验证了其抗病性。本研究以F1代转基因公猪与野生型母猪杂交获得的F2代抗PCV2转基因猪为对象,分别从DNA水平、RNA水平及活体水平对其遗传表达稳定性、抗PCV2感染效果进行检测与分析,以获得安全、有效的抗PCV2转基因猪新品种。主要结果如下:(1)经生物荧光灯、PCR检测,出生的37头F2代猪中有26头转基因猪,阳性率达70.2%,外源基因能够稳定遗传。(2)si RNA在转基因猪体内能够表达,不同个体同一组织的si RNA表达量存在显著差异(P0.01)。(3)利用PCV2加免疫刺激物的方式对仔猪攻毒可引起PMWS症状,血清病毒数较低时,转基因猪具有一定的抗病毒效果。(4)攻毒后,四组抗体水平都先下降后回升。A组(转基因直接感染组)和C组(转基因接触组)的回升速度分别快于B组(野生型直接感染组)和D组(野生型接触组),且在第56天C组抗体水平显著高于D组。(5)血常规结果显示,A组和B组、C组和D组各个时期各项血液指标都没有显著性差异(p0.05)。该结果说明,转基因猪和野生型猪机体的新陈代谢和功能调节基本保持一致。(6)攻毒期间猪只各个时期的体重结果显示,转基因猪和野生型体重没有差异(p0.05)。(7)攻毒后采集仔猪组织器官进行免疫组化实验的结果显示,转基因和野生型猪中PCV2蛋白的沉积没有差异。综上所述,所获得的转基因猪都能表达抑制PCV2的siRNA;活体攻毒后猪只血清抗体先下降后上升,血清病毒数较低时,转基因猪具有一定的抗病毒效果;血常规结果表明,外源基因的转入不影响猪只的新陈代谢和机体机能。
【关键词】：PCV2 转基因猪 抗病力 病毒拷贝数 血常规
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：
- 摘要3-5
- Abstract5-10
- 1 前言10-14
- 1.1 猪圆环病毒病原学及其相关疾病的简介10-11
- 1.2 目前对于猪圆环病毒病的防治措施11-12
- 1.3 利用RNAi技术和转基因技术培育抗圆环病毒猪新品种的研究进展12-14
- 1.4 研究的目的及意义14
- 2 材料与方法14-23
- 2.1 实验材料14
- 2.1.1 实验动物和PCV2毒株14
- 2.2 实验方法14-23
- 2.2.1 利用荧光灯观察EGFP蛋白在抗PCV2转基因猪中的表达情况15
- 2.2.2 利用PCR方法检测目的基因在转基因猪中的整合15-16
- 2.2.3 利用茎环引物法检测不同转基因猪肾脏小RNA转录表达情况16-23
- 2.2.4 数据分析23
- 3 结果与分析23-37
- 3.1 F2代转基因猪绿色荧光蛋白基因的表达检测23-24
- 3.2 F2代转基因猪PCR鉴定24-25
- 3.3 F2代转基因猪肾组织抗PCV2 siRNA表达检测25-26
- 3.4 F2代转基因猪与对照猪抗PCV2感染能力比较26-37
- 3.4.1 攻毒前PCV2病毒滴度测定26-27
- 3.4.2 攻毒前血清抗原和抗体水平检测27-28
- 3.4.3 攻毒后血液PCV2病毒拷贝数变化28-31
- 3.4.4 攻毒后血液生化指标的变化31-33
- 3.4.5 攻毒后体重变化33-35
- 3.4.6 攻毒后血清中PCV2抗体水平的变化35-36
- 3.4.7 攻毒结束后组织免疫组化学分析36-37
- 4 讨论与结论37-43
- 4.1 RNAi技术在抗病毒育种上的应用37-39
- 4.2 转基因动物的检测39-40
- 4.3 PCV2活体攻毒实验存在的难点和解决途径40-41
- 4.4 本研究中转基因猪抗PCV2效果的探讨41
- 4.5 结论41-43
- 致谢43-44
- 参考文献44-48
- 附录A48-50
- 附录B50-51
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨利勇;李春凤;;猪圆环病毒2型在我国的流行及疫苗研究现状[J];畜牧与兽医;2015年04期
2 陈少康;王晓凤;李爽;郭峰;王莹;云鹏;;猪血常规指标辅助评价健康种猪的初步研究[J];吉林畜牧兽医;2015年03期
3 何世斌;柴连琴;谭s，
本文编号：856012
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