牦牛Ghrelin对其极端生境适应的分子机理

发布时间：2017-09-16 03:25

  本文关键词：牦牛Ghrelin对其极端生境适应的分子机理

  更多相关文章： 青藏高原 牦牛 能量代谢 神经调控 饥饿素

【摘要】：牦牛是适应青藏高原高寒、低氧、枯草期慢长等极端自然环境而生存、繁衍和生产的大型哺乳动物之一。饥饿素(Ghrelin)是生长激素促分泌素受体的唯一内源性配体,也是唯一可以在外周刺激食欲的激素,其在“下丘脑—垂体—消化道”能量代谢系统中,作为“脂质传感器”,通过“神经元突触、迷走神经和血液循环”传导,参与着机体食欲、体重、肠胃功能、脂肪、葡萄糖及脂类代谢等多项任务的调节,最终在下丘脑协同调控机体的能量代谢。因此,为了探讨青藏高原动物对其极端生态环境适应的遗传机制,本论文以牦牛为研究对象,以低海拔黄牛为对照,以Ghrelin为靶点,通过基因克隆技术与序列比对分析、mRNA水平定量分析、蛋白定位及定量分析,并结合文献挖掘和生物信息学研究方法构建牦牛Ghrelin参与能量代谢的基因调控网络模型,系统探讨了青藏高原牦牛Ghrelin对其极端生境适应的分子机理。结果1.本论文初步克隆了牦牛下丘脑Ghrelin基因CDS的全长序列,该序列仅含有一个351bp的开放阅读框,其编码117个氨基酸;牦牛Ghrelin基因CDS全长序列编码的氨基酸序列与黄牛、绵羊、山羊和藏羚羊的同源性极高,分别为100%、91.38%、92.24%和92.24%;而与马、驴、人、大鼠和小鼠的同源性较低,其分别为67.52%、68.38%、69.83%、70.09%和68.97%,且该氨基酸序列的系统进化情况与其亲缘关系远近一致。2.实时荧光定量PCR结果表明,牦牛和黄牛的下丘脑、垂体、皱胃和十二指肠中均有Ghrelin mRNA的表达,但表达趋势不尽相同,其中牦牛皱胃和下丘脑Ghrelin mRNA的表达水平均极显著地低于黄牛的(p0.001),分别为黄牛的0.5倍和0.7倍;而牦牛十二指肠和垂体Ghrelin mRNA的表达水平却均极显著地高于黄牛(p0.001),分别为黄牛的8倍(p0.001)和2倍。3.免疫组化结果表明,牦牛十二指肠、空肠、回肠和盲肠中均有Ghrelin免疫阳性产物的分布,大量阳性产物主要分布于小肠腺分泌细胞,而在小肠腺腺泡基底膜上仅有少量分布;然而,在对照组黄牛中该阳性产物主要表达于黏膜层小肠腺腺泡基底膜。此外,免疫荧光结果表明,十二指肠Ghrelin蛋白的红色荧光标记物分布特征与免疫组化的相一致。4.ELISA分析结果表明,在牦牛和黄牛下丘脑、垂体、皱胃和十二指肠中Ghrelin蛋白总表达量(Total levels,TL)的表达趋势一致,即TL皱胃TL十二指肠TL垂体TL下丘脑;但牦牛上述各组织Ghrelin蛋白的表达水平均极显著地高于黄牛的(p0.001)。5.在牦牛Ghrelin参与能量代谢的基因调控网络模型中,Ghrelin通过与其受体GHSR直接或间接互作协同参与机体能量代谢调控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH、Leptin、Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK和PYY共计16个。6.成功构建了牦牛Ghrelin CDS编码序列的真核荧光表达质粒pEGFP-Ghrelin。结论1.在反刍动物的进化中,Ghrelin的氨基酸序列具有极高的保守性,其与生境特征没有必然的联系。2.与低海拔黄牛相比,牦牛在高寒、低氧、枯草期漫长等极端高原生境适应的能量代谢调控中,“下丘脑-垂体-消化道”轴高表达的Ghrelin蛋白,可能通过提高食欲促进进食、增加脂肪积累、调控体温、降低能量消耗,而适应其极端生境。3.在牦牛Ghrelin参与能量代谢的基因调控网络模型中,与Ghrelin通过其受体GHSR相互绑定直接互作协同参与机体能量代谢调控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH和Leptin 6个,其中前5个参与能量平衡的正调控,Leptin参与能量平衡的负调控;与Ghrelin间接互作协同参与机体能量代谢调控的基因有Motilin、Orexin、OX1R、OX2R、GH、MC4R、POMC、CCK、CCKAR、CCKBR和PYY共计11个,其中前5个参与能量平衡的正调控,后6个参与能量平衡的负调控。其为进一步系统探讨青藏高原草食动物尤其牦牛适应其极端生境Ghrelin参与能量代谢的基因调控网络奠定了一定的理论基础。
【关键词】：青藏高原 牦牛 能量代谢 神经调控 饥饿素
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.85
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文献综述11-24
• 1.1 牦牛及其能量代谢特征11-12
• 1.1.1 牦牛11
• 1.1.2 青藏高原生境特征11
• 1.1.3 青藏高原动物/牦牛能量代谢特征11-12
• 1.2 能量代谢与神经调控12-15
• 1.2.1 下丘脑12-15
• 1.2.2 腺垂体15
• 1.3 Ghrelin15-23
• 1.3.1 Ghrelin的结构组成及其加工15-18
• 1.3.2 Ghrelin的定位18-19
• 1.3.3 Ghrelin的酰基化19-20
• 1.3.4 Ghrelin的功能20-23
• 1.4 小结23-24
• 第二章 实验材料与方法24-36
• 2.1 实验材料24-27
• 2.1.1 实验动物24
• 2.1.2 载体与菌株24
• 2.1.3 实验主要试剂24-25
• 2.1.4 溶液配制25-26
• 2.1.5 实验仪器26-27
• 2.2 实验方法27-36
• 2.2.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆27-29
• 2.2.1.1 脑牛下丘脑总RNA的提取27-29
• 2.2.2 Real-Time Quantitative PCR29-31
• 2.2.3 石蜡切片及免疫组织化学染色31-33
• 2.2.4 免疫荧光化学染色33
• 2.2.5 ELISA33
• 2.2.6 牦牛下丘脑能量代谢相关因子调控网络模型构建33
• 2.2.7 牦牛Ghrelin基因高效真核表达载体构建33-36
• 第三章 实验结果36-49
• 3.1 牦牛Ghrelin基因CDS序列的克隆36-39
• 3.1.1 牦牛总RNA提取及凝胶电泳分析36
• 3.1.2 牦牛Ghrelin基因的PCR扩增36-37
• 3.1.3 牦牛Ghrelin基因克隆及重组子鉴定37
• 3.1.4 牦牛Ghrelin氨基酸序列的系统发育分析37-39
• 3.2 牦牛Ghrelin基因mRNA水平的表达研究39-40
• 3.3 牦牛Ghrelin蛋白在小肠及大肠的免疫组织化学定位40-44
• 3.3.1 Ghrelin在牦牛十二指肠中的定位41-42
• 3.3.2 Ghrelin在牦牛空肠中的定位42
• 3.3.3 Ghrelin在牦牛回肠中的定位42-43
• 3.3.4 Ghrelin在牦牛盲肠中的定位43-44
• 3.4 牦牛Ghrelin的蛋白定量研究44
• 3.5 牦牛下丘脑Ghrelin参与能量代谢的调控网络模型44-47
• 3.5.1 Ghrelin44-45
• 3.5.2 NPY45-46
• 3.5.3 瘦素（Leptin）46
• 3.5.4 胆囊收缩素（CCK）46-47
• 3.5.5 食欲素（Orexin）47
• 3.6 牦牛Ghrelin基因高效真核表达载体的构建47-49
• 3.6.1 牦牛Ghrelin基因的获取47-48
• 3.6.2 重组质粒的构建及鉴48-49
• 第四章 讨论49-55
• 4.1 牦牛Ghrelin参与食欲和能量代谢基因的生物信息学特征49-50
• 4.2 牦牛Ghrelin参与食欲和能量代谢的表达特征50-51
• 4.3 牦牛Ghrelin参与能量代谢的基因调控网络模型51-55
• 第五章 结论55-56
• 参考文献56-69
• 附录69-70
• 在学期间的研究成果70-71
• 致谢71

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