结核菌中药抗菌增效剂的筛选及黄连总生物碱对PhoPR双组份系统基因转录水平的影响

发布时间：2017-09-22 11:23

  本文关键词：结核菌中药抗菌增效剂的筛选及黄连总生物碱对PhoPR双组份系统基因转录水平的影响

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【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由革兰氏阳性细菌——结核分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患传染病。结核病不仅威胁到动物的生命安全,也影响到人类的健康。目前治疗结核病以一、二线化学药物为主,但由于长期的不合理用药,导致大量耐药结核菌的产生,给治疗带来了巨大的困难,寻找新的治疗方案势在必行。中药是我国特有的自然资源,并且具有在治疗疾病时不易产生耐药性和副作用等优点,因此本试验旨在从我国的中药资源中筛选出新的、理想的结核分枝杆菌多药耐药逆转剂或抗菌增效剂,并对其抗菌增效的机理进行初步的研究和探讨。本试验通过比例法对44株鹿源结核菌进行多药耐药性的检测,结果显示只有MT-7、MB-1确定为多药耐药结核菌,以其作为试验模型菌。用水提法和醇提法制备24种中药的浸膏,将浸膏溶解后通过微量稀释(Microdilution alamar blueassay,MABA)法作用于多药耐药菌MT-7、MB-1,以标准敏感菌H37Rv为对照,结果显示黄连、独活和侧柏叶有明显的抗结核活性,其中黄连水粗提物和乙醇粗提物效果最佳。将筛选出有抗结核菌作用的中药提取物与RFP和INH通过棋盘法联合作用于MT-7、MB-1、H37Rv,其结果显示黄连醇提物与RFP联合作用MT-7、MB-1、H37Rv,显示有协同作用,表明黄连醇提物是RFP的抗菌增效剂。提取和纯化黄连浸膏中的总生物碱,以核酸染料法测定黄连水粗提物、乙醇粗提物、纯化物中总碱的含量,采用MABA法测定黄连提取物、黄连生物碱与小檗碱的抗结核菌的活性,结果显示,纯化物总生物碱含量最高且抗结核菌的效果最佳,比单体小檗碱的效果还要好。用分离及纯化得到的黄总生物碱通过棋盘法与六种抗结核化学药物合用,结果显示黄连总碱与RFP合用对MT-7、MB-1、H37Rv均有协同作用,其FIC值均≤0.5,表明黄连生物碱是RFP的抗菌增效剂;同时检测了黄连总碱和小檗碱对细胞的毒性,黄连总碱和小檗碱在≥100μg/mL时对细胞具有毒性作用,此剂量远高于黄连总碱和小檗碱对结核菌的MIC值。因此,从毒性方面来看,该试验结果可以为临床黄连总碱用药提供依据。分别用不同浓度的黄连总生物碱、黄连总生物碱与RFP联合作用MT-7、MB-1、H37Rv,提取总RNA,采用荧光定量PCR方法分析比较与耐药性有关PhoPR双组分系统的PhoP和PhoR的基因的表达水平,其结果显示,在高浓度黄连生物碱作用时,多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降,说明黄连总生物碱降低MB-1、MT-7的耐药性;并且黄连总生物碱与RPF联合作用时,多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降,说明黄连总生物碱与RFP能协同抑制结核菌,进一步表明黄连生物碱是RFP抗菌增效剂,其抗菌增效机制需要进一步深入研究。本研究选取有抑菌作用的24种中药,并成功筛选出有明显抗菌增效作用的中药黄连,从而为解决动物源结核分枝杆菌的耐药性问题做出了有益的探索。
【关键词】：鹿源结核菌 中药 抗菌增效剂 黄连总生物碱 PhoPR双组分系统
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.618
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-22
• 第一章 结核病篇10-15
• 1.1 鹿结核病的概述10-12
• 1.2 多药耐药结核病的概述12-15
• 第二章 中药抗菌增效剂的研究15-18
• 2.1 中药抗结核分枝杆菌的研究15-16
• 2.2 中药耐药抑制剂的研究16-18
• 第三章 结核菌PhoPR双组份系统的研究现状18-22
• 3.1 PhoPR双组份系统的结构18
• 3.2 PhoPR与细胞壁或细胞膜18-19
• 3.3 PhoPR与结核分枝杆菌的毒力19-20
• 3.4 PhoPR对结核分枝杆菌在巨噬细胞生存的影响20-21
• 3.5 PhoPR与结核分枝杆菌的新型疫苗有关21-22
• 第二篇 研究内容22-59
• 第一章 结核菌中药抗菌增效剂的筛选22-34
• 1.1 材料22-23
• 1.2 方法23-28
• 1.3 结果28-33
• 1.4 讨论33
• 1.5 小结33-34
• 第二章 黄连总生物碱抗菌增效作用的研究34-48
• 2.1 材料34-35
• 2.2 方法35-39
• 2.3 结果39-45
• 2.4 讨论45-47
• 2.5 小结47-48
• 第三章 黄连总生物碱对结核菌PhoPR双组份系统基因转录水平的影响48-59
• 3.1 材料48-49
• 3.2 方法49-53
• 3.3 结果53-57
• 3.4 讨论57-58
• 3.5 小结58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-67
• 作者简介67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：900533