禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白的原核表达及单克隆抗体的研制与标准抗原抗体的制备

发布时间：2017-09-23 21:03

  本文关键词：禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白的原核表达及单克隆抗体的研制与标准抗原抗体的制备

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【摘要】：传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)引起的鸡的一种呼吸道传染病。主要临床症状为咳出含有血液的渗出物并伴发高死亡率,引起流鼻涕、结膜炎、体重和产蛋下降。本病自1925年首次报道以来,现已遍布各养禽国家和地区,我国主要呈地方流行。本研究利用原核表达系统成功表达重组蛋白His-gJ,并研制了3株针对ILTV gJ蛋白的单克隆抗体。同时以ILTV王岗(WG)株免疫SPF鸡制得多抗血清,对ILTV抗原和抗血清进行一系列标定,获得了ILTV的标准抗原和标准血清,为ILTV的诊断和防治提供了有效的方法和材料。1、抗禽传染性喉气管炎病毒酣蛋白原核表达与单克隆抗体的研制根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒gJ全基因序列设计gJ编码区(445-745位氨基酸)的特异性引物,上下游引物分别引入酶切位点BamHI和Xho I,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a-gJ并转化到BL21(DE3)。经IPTG诱导后,获得大小为55KD的重组蛋白His-gJ。并利用亲和柱对重组蛋白His-gJ进行纯化,SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,融合蛋白His-gJ具有良好的抗原性；利用获得的ILTV重组蛋白His-gJ为抗原,建立检测ILTV抗体的ELISA方法。以ILTV WG株全病毒作为免疫原,按照常规程序免疫6-8周龄Balb/c小鼠,取脾细胞与S/P20细胞融合,利用重组蛋白His-gJ进行间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性细胞株,最终得到3株分泌针对ILTV gJ蛋白单克隆抗体的阳性细胞株,分别命名为：ILTV-gJ-4C6、ILTV-gJ-5B8、ILTV-gJ-6B6。Western-Blot与间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,所得三株单抗均能与ILTV WG株天然病毒发生特异性反应。3株单克隆抗体的抗体亚类均为IgG1,Kappa链。利用亲和层系技术分别纯化了3株单抗腹水,获得了高纯度的单克隆抗体,为今后建立ILTV检测技术提供了良好的试剂材料。2、禽传染性喉气管炎病毒标准抗原及血清的制备本研究用SPF鸡胚扩增禽传染性喉气管炎病毒WG株,对收集的传染性喉气管炎病毒进行了病毒含量测定分析,结果该材料中病毒为10-49ELD50/0.2mL。血凝试验(HA)、聚合酶链式反应(PCR)及ELISA实验技术进一步鉴定了该病毒无传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、小鹅瘟病毒(GPV)、马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡产蛋下降综合症(EDS-76)、禽白血病病毒(ALV)等外源性病毒污染,无菌检验也证明该病毒材料无菌生长、无支原体污染。将该ILTV全病毒抗原经一系列标定,加入1%BSA冻存保护剂,分装,冻干,并进行物理性状和无菌检验及支原体污染检验,最后获得了ILTV的标准抗原。将ILTV WG株多次免疫SPF鸡,制得了抗ILTV多抗血清,用重组融合蛋白酣进行间接ELISA检测,结果表明该血清的ELISA效价为1：1200。利用HI、IFA实验技术鉴定该多抗血清抗体,证明该血清与上述其他病毒多抗血清无交叉反应性,仅与ILTV反应,特异性良好；无菌检验、支原体检验合格。经一系列标定后,在血清中加入万分之一的硫柳汞防腐剂,分装,冻干,并进行物理性状的检查以及均一性、稳定性、长期保存性的鉴定,最终获得了高质量的标准血清。通过标定阳性及弱阳性血清,对目前市场上常用的商品化检测ILTV抗体的ELISA试剂盒可靠性进行了测定,证明所试两种商品化ELISA试剂盒可用于临床样品检测。
【关键词】：传染性喉气管炎病毒 gJ蛋白 单克隆抗体 标准抗原 标准血清 ELISA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 符号说明12-14
• 文献综述14-30
• 1 病原学14-21
• 1.1 病毒分类及基本结构14-15
• 1.2 理化特性15
• 1.3 生物学特性15-16
• 1.4 病毒基因组结构16-20
• 1.4.1 gB基因18
• 1.4.2 gC基因18
• 1.4.3 gD基因18-19
• 1.4.4 gG基因19
• 1.4.5 gJ基因19
• 1.4.6 TK基因19-20
• 1.4.7 其它基因20
• 1.5 病毒复制20-21
• 2 流行病学21
• 3 临床症状及病理学变化21-22
• 4 诊断22-24
• 4.1 组织学检查22
• 4.2 电镜检查22-23
• 4.3 病毒分离23
• 4.4 免疫荧光试验23
• 4.5 琼脂扩散试验23
• 4.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)23-24
• 4.7 病毒中和试验24
• 4.8 聚合酶链式反应(PCR)24
• 5 防制24-25
• 6 兽用生物制品国家标准物质的研究现状25-30
• 6.1 OIE传染性喉气管炎病毒检测技术标准25-26
• 6.2 标准物质的作用26-27
• 6.3 我国兽用标准物质现状27-30
• 研究内容一 禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白表达与单克隆抗体的研制30-53
• 1 材料31
• 1.1 生物材料31
• 1.2 试剂与载体31
• 2 方法31-42
• 2.1 ILTV gJ蛋白的原核表达31-36
• 2.1.1 引物设计及目的片段的扩增31-32
• 2.1.2 目的片段的克隆32-33
• 2.1.3 重组质粒的转化33
• 2.1.4 阳性质粒的提取及鉴定33
• 2.1.5 ILTV gJ基因原核表达载体的构建33-34
• 2.1.6 重组蛋白His-gJ的诱导表达34-35
• 2.1.7 重组蛋白His-gJ蛋白的纯化35
• 2.1.8 Western-blot鉴定重组蛋白His-gJ抗原性35-36
• 2.2 抗ILTV gJ单克隆抗体的制备36-40
• 2.2.1 动物免疫36
• 2.2.2 细胞融合的准备36
• 2.2.3 饲养细胞的制备36-37
• 2.2.4 细胞融合37
• 2.2.5 阳性克隆筛选方法的建立37
• 2.2.6 阳性杂交瘤的筛选37-38
• 2.2.7 阳性杂交瘤的亚克隆及冻存38
• 2.2.8 单克隆抗体的特性鉴定38-39
• 2.2.9 腹水的制备及纯化39-40
• 2.3 检测ILTV抗体间接ELISA方法的初步建立40-42
• 2.3.1 间接ELISA的程序40-41
• 2.3.2 最适抗原包被量与抗体工作浓度的优化41
• 2.3.3 最适反应时间的确定41
• 2.3.4 最适显色时间的确定41-42
• 2.3.5 临界值的确定42
• 3 结果42-51
• 3.1 gJ蛋白的表达42-45
• 3.1.1 ILTV WG株gJ基因扩增结果42-43
• 3.1.2 pET-32a-gJ原核表达载体的构建43-44
• 3.1.3 重组蛋白的诱导表达44
• 3.1.4 重组蛋白的纯化及抗原性鉴定44-45
• 3.2 抗ILTV gJ单克隆抗体的制备45-49
• 3.2.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选45-46
• 3.2.2 单克隆抗体亚型鉴定46
• 3.2.3 单克隆抗体与全病毒反应性46-47
• 3.2.4 IFA证实单抗能识别细胞感染中的病毒抗原47-48
• 3.2.5 抗体纯化效果48-49
• 3.3 检测ILTV抗体间接ELISA方法的初步建立49-51
• 3.3.1 最适抗原包被量与抗体工作浓度49-50
• 3.3.2 最适反应时间的确定50-51
• 3.3.3 最适显色时间的确定51
• 3.3.4 临界值的确定51
• 4 小结和讨论51-53
• 研究内容二 禽传染性喉气管炎病毒标准抗原及抗体的制备53-73
• 1 材料54
• 1.1 生物材料54
• 1.2 主要仪器和试剂54
• 2 方法54-62
• 2.1 ILTV标准抗原的制备54-55
• 2.1.1 病毒扩增54-55
• 2.1.2 病毒基因组的提取55
• 2.2 ILTV多抗血清的制备55
• 2.3 禽传染性喉气管炎病毒标准物质的标定55-62
• 2.3.1 标准抗原的纯粹性鉴定55-57
• 2.3.2 病毒抗原中病毒ELD50含量的测定57
• 2.3.3 标准血清的ELISA反应性的测定57-58
• 2.3.4 ILTV多抗血清特异性鉴定58
• 2.3.5 阳性及弱阳性血清的确定58
• 2.3.6 标准抗原及血清的分装58-59
• 2.3.7 物理性状的检查59
• 2.3.8 无菌检验59
• 2.3.9 支原体检验59-60
• 2.3.10 血清效价测定60
• 2.3.11 血清均一性检验60
• 2.3.12 血清稳定性检验60
• 2.3.13 血清长期保存性测定60
• 2.3.14 ILTV标准抗体用于商品化ELISA试剂盒的检验60-62
• 3 结果62-71
• 3.1 ILTV标准抗原的制备62
• 3.1.1 标准抗原中ICP4基因62
• 3.2 禽传染性喉气管炎病毒标准物质的标定62-71
• 3.2.1 标准抗原的纯粹性鉴定结果62-63
• 3.2.2 标准抗原中病毒ELD50含量63-64
• 3.2.3 标准血清的ELISA反应性64-65
• 3.2.4 标准血清抗体的特异性65-67
• 3.2.5 阳性及弱阳性血清的确定67
• 3.2.6 标准物质的分装67
• 3.2.7 物理性状的检查67
• 3.2.8 无菌检验67-68
• 3.2.9 支原体检验68
• 3.2.10 冻干和防腐剂处理对标准抗体效价的影响68-69
• 3.2.11 均一性69
• 3.2.12 稳定性69
• 3.2.13 长期保存69-70
• 3.2.14 ILTV标准抗体对商品化ELISA试剂盒检验结果70-71
• 4 小结和讨论71-73
• 全文总结73-74
• 参考文献74-83
• 致谢83-84

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