Mybph基因在肌细胞增殖、分化中的调控作用研究

发布时间：2017-09-24 17:33

  本文关键词：Mybph基因在肌细胞增殖、分化中的调控作用研究

  更多相关文章： 骨骼肌 增殖 分化 细胞周期 Mybph 转录调控

【摘要】：肌肉发育过程是一个十分复杂的进程,在其发育过程中受到了很多基因及转录因子的调控。由于肌肉发育的复杂性,虽然现在已经确定了一批对肌肉发育有调控作用的调控因子,但仍有很多与肌发育相关的基因或转录因子有待研究。有研究报道,Mybph基因在肌肉发育过程中差异性表达,而且会与其它转录因子共同作用调控肌肉发育。因此,为了验证Mybph基因对肌细胞的调控作用,我们检测了猪不同组织中Mybph基因的相对表达情况;通过生物信息学对Mybph蛋白表达位置进行预测,并使用激光共聚焦技术进行验证;检测Mybph基因在C2C12细胞分化过程中的时空表达;构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Mybph和合成Mybph基因的干涉片段,转染C2C12细胞,通过实时无标记细胞分析技术(RTCA)、免疫荧光技术、western blot、流式细胞术、荧光定量PCR技术等分析Mybph基因对肌细胞生长的影响。主要研究结果如下:1.运用RT-PCR技术检测了猪心、肝、脾、肺、肾、背肌、卵巢、子宫内膜、垂体和下丘脑等10个组织中Mybph基因的表达量。结果显示,Mybph基因在各组织都有表达,在背肌中表达量最高,在其余组织的相对表达量较低。2.利用生物信息学的方法对Mybph蛋白在细胞中的表达位置进行预测,发现Mybph蛋白有98.5%的可能是在细胞质表达,只有1.5%的可能性在细胞核表达。此外,通用激光共聚焦技术对Mybph蛋白在肌细胞中的表达位置进行了验证,结果显示,Mybph蛋白在细胞质表达,与生物信息学预测相吻合。3.利用RT-PCR方法检测Mybph基因在C2C12细胞分化过程中的时空表达情况,结果显示,随着细胞分化,相对表达量升高。4.利用RT-PCR技术检测上调/下调Mybph基因对肌细胞分化相关基因Myog、Myhc和Myomaker相对表达量的影响。结果显示,上调Mybph基因使得肌细胞分化相关基因的相对表达量总体下降,下调Mybph基因使得肌细胞分化相关基因的相对表达量总体上升。5.运用实时无标记细胞分析技术检测上调/下调Mybph基因对C2C12细胞增殖的影响,发现上调Mybph基因能够抑制细胞数目的增殖,下调Mybph基因能够促进细胞的增殖。6.使用免疫荧光技术和western blot技术在蛋白水平检测上调/下调Mybph对细胞增殖标记蛋白Ki67表达量的影响。结果发现,上调Mybph基因能够抑制Ki67的表达,下调Mybph基因能够促进Ki67的表达。7.运用流式细胞术检测上调/下调Mybph基因对C2C12细胞周期的影响,结果显示,Mybph参与了细胞周期的调节,上调Mybph会使得更多细胞停留在G1期,下调Mybph会使得更多细胞停留在G2期和S期。
【关键词】：骨骼肌 增殖 分化 细胞周期 Mybph 转录调控
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩略语表12-13
• 1 前言13-22
• 1.1 研究问题的由来13
• 1.2 骨骼肌生长发育调控相关研究13-18
• 1.2.1 骨骼肌发育的基本过程14-15
• 1.2.2 骨骼肌生长发育过程中主要调控因子研究进展15-17
• 1.2.3 骨骼肌的再生17-18
• 1.3 Mybph基因研究进展18-21
• 1.3.1 Mybph基因的结构18-19
• 1.3.2 Mybph基因的功能研究进展19-21
• 1.4 研究目的与意义21-22
• 2 实验材料与方法22-42
• 2.1 材料22-26
• 2.1.1 猪组织样品22
• 2.1.2 细胞系、载体和菌株22-23
• 2.1.3 主要试剂与试剂盒23-24
• 2.1.4 主要试剂的配制24-25
• 2.1.5 主要仪器设备25-26
• 2.1.6 主要生物学分析软件及网站26
• 2.2 试验方法26-42
• 2.2.1 组织和细胞总RNA的提取26-27
• 2.2.2 cDNA的合成27-28
• 2.2.3 引物的设计28-29
• 2.2.4 PCR扩增反应29
• 2.2.5 猪组织表达谱的构建29-30
• 2.2.6 真核表达载体的构建30-33
• 2.2.7 干涉片段的合成33
• 2.2.8 细胞培养及质粒转染33-35
• 2.2.9 激光共聚焦技术35
• 2.2.10 细胞增殖实验35-36
• 2.2.11 免疫荧光技术36-37
• 2.2.12 Western Blot技术37-40
• 2.2.13 细胞周期的测定40-42
• 3 结果与分析42-56
• 3.1 Mybph基因的组织表达谱42
• 3.2 生物信息学对小鼠Mybph蛋白亚细胞定位的预测42-43
• 3.3 Mybph在C2C12细胞中的表达定位43-44
• 3.4 真核表达载体pcDNA3.1(+)-Mybph的构建44-46
• 3.4.1 C2C12细胞RNA的提取及cDNA的合成44-45
• 3.4.2 PMD-18T-Mybph质粒与真核表达载体pcDNA3.1(+)的双酶切45-46
• 3.5 干涉片段的选择46
• 3.6 Mybph基因在C2C12细胞分化过程中的时空表达情况46-47
• 3.7 Mybph基因对C2C12细胞分化的影响47-50
• 3.7.1 超表达Mybph基因对C2C12细胞分化的影响47-48
• 3.7.2 干涉Mybph基因对C2C12细胞分化的影响48-50
• 3.8 Mybph基因对C2C12细胞增殖的影响50-54
• 3.8.1 实时无标记分析技术（RCTA）检测Mybph基因对C2C12细胞增殖的影响50-51
• 3.8.2 免疫荧光技术检测Mybph基因对C2C12细胞增殖影响51-54
• 3.8.3 Western blot检测Mybph基因对C2C12细胞增殖影响54
• 3.9 Mypbh基因对细胞周期的影响54-56
• 4 讨论56-59
• 4.1 Mybph基因在成肌细胞时空分化过程中表达差异56
• 4.2 Mybph基因在猪不同组织的差异性表达56
• 4.3 Mybph基因对成肌细胞增殖、分化的调控56-58
• 4.3.1 Mybph基因对成肌细胞分化的影响57
• 4.3.2 Mybph基因对成肌细胞增殖的影响57-58
• 总结58-59
• 5 小结59-61
• 5.1 本研究的主要结果59-60
• 5.2 本研究的创新点60
• 5.3 下一步工作计划60-61
• 参考文献61-69
• 致谢69

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