DMSO和EG中添加BSA对羔羊睾丸组织冷冻保存效果的影响

发布时间：2017-09-24 14:39

  本文关键词：DMSO和EG中添加BSA对羔羊睾丸组织冷冻保存效果的影响

  更多相关文章： 羔羊睾丸组织 冷冻保护剂 激素释放量 酶活性 基因相对表达量

【摘要】：睾丸组织的成功冷冻保存不仅为濒危野生动物和优良家畜的生殖能力保存提供了有效途径,也为经过放疗或化疗治愈后的未成年男性患者生殖能力恢复提供了新的选择。在睾丸组织冷冻保存过程中,冷冻保护剂为防止睾丸组织的冷冻损伤发挥了重要作用。目前用于睾丸组织冷冻保存的保护剂大部分属于渗透性冷冻保护剂,主要通过渗透到细胞内减少冰晶的形成来起到保护细胞的作用。但是,渗透性冷冻保护剂大多具有一定的毒性,会破坏细胞通路,导致细胞内的酶变性,损伤DNA结构等。为了探讨在渗透性冷冻保护剂(二甲基亚砜和乙二醇)中添加牛血清白蛋白(BSA)对冻后羔羊睾丸组织活性的影响,本试验以10%的二甲基亚砜(DMSO)、10%的乙二醇(EG)、10%DMSO+5 g/L BSA和10%EG+5 g/L BSA作为冷冻保护剂,研究不同冷冻保护剂对冻后羔羊睾丸组织形态、激素释放量、标志性酶活性、抗氧化能力和关键基因相对表达量的影响。本研究获得的主要结果如下:1.10%DMSO+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织细胞活率、曲细精管完整率以及睾酮、抑制素的释放量分别为79.97%、88.08%、137.73 nmol/L和1507.92 ng/L,均显著高于其他冷冻保护剂(P0.05),但显著低于新鲜组织(P0.05);10%EG+5 g/L BSA与10%DMSO冷冻后的睾丸组织细胞活率、曲细精管完整率以及睾酮、抑制素的释放量仅次于10%DMSO+5 g/L BSA组,但显著高于10%EG组(P0.05),且两组之间差异不显著(P0.05)。2.10%DMSO+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织的碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)和总抗氧化能力(T-AOC)的活性分别为198.63 U/gprot、33.04 U/gprot,137.23 U/gprot和1.62 U/mgprot,均显著高于其他冷冻组(P0.05),但显著低于新鲜组织(P0.05);10%DMSO+5 g/L BSA和10%EG+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为1444.50 U/gprot和1324.20 U/gprot,显著高于其他冷冻组(P0.05),且两组之间差异不显著(P0.05);10%DMSO+5 g/L BSA和10%EG+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织丙二醛(MDA)含量分别1.63 U/mgprot和1.80U/mgprot,显著低于其他冷冻组(P0.05),且两组之间差异不显著(P0.05)。3.10%DMSO+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织Caspase-3相对表达量显著低于其他冷冻组(P0.05),且显著高于新鲜组织(P0.05);CD90相对表达量在各冷冻组之间差异不显著(P0.05),且均显著低于新鲜组织(P0.05);10%DMSO+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织GDNF相对表达量显著高于10%DMSO组和10%EG组(P0.05),且与10%EG+5 g/L BSA组差异不显著(P0.05);10%DMSO+5 g/L BSA冷冻后的睾丸组织Oct-4相对表达量显著高于10%EG组(P0.05),且与10%EG+5 g/L BSA组和10%DMSO组差异不显著(P0.05)。在10%DMSO中添加5 g/L BSA有效提高了冻后羔羊睾丸组织的形态、激素释放量、标志性酶活性、抗氧化能力以及关键基因的相对表达量,说明在DMSO中添加BSA具有可行性,为睾丸组织冷冻保护剂的选择提供了新的思路,为睾丸组织的冷冻保存提供了可靠的理论依据。
【关键词】：羔羊睾丸组织 冷冻保护剂 激素释放量 酶活性 基因相对表达量
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 文献综述13-22
• 第一章 睾丸组织冷冻保存研究进展13-22
• 1.1 睾丸组织冷冻保存意义13-14
• 1.2 睾丸组织冷冻保护剂研究进展14-15
• 1.3 细胞的冷冻损伤机理15-16
• 1.3.1 细胞冷冻损伤的两因素假说15-16
• 1.3.2 电解质失衡假说16
• 1.3.3 物理屏障假说16
• 1.3.4 结构水假说16
• 1.3.5 生物膜伤害假说16
• 1.4 冷冻保护剂的保护机制16-17
• 1.5 睾丸内激素17-18
• 1.5.1 睾酮17
• 1.5.2 抑制素17-18
• 1.6 睾丸组织的标志性酶18-19
• 1.6.1 碱性磷酸酶18
• 1.6.2 酸性磷酸酶18
• 1.6.3 乳酸脱氢酶18
• 1.6.4 γ-谷氨酰转肽酶18-19
• 1.7 睾丸组织冷冻过程中的氧化损伤19
• 1.8 睾丸组织的关键基因19-20
• 1.8.1 Oct-419
• 1.8.2 GDNF19-20
• 1.8.3 Caspase-320
• 1.8.4 CD9020
• 1.9 睾丸组织冷冻在新的生殖技术方面的应用20-21
• 1.9.1 生殖细胞的移植20-21
• 1.9.2 睾丸组织的异体移植21
• 1.9.3 生殖细胞的体外培养21
• 1.10 本研究的目的和意义21-22
• 试验研究22-46
• 第二章 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织形态和激素释放量的影响22-30
• 2.1 材料与方法23-25
• 2.1.1 羔羊睾丸组织的采集23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.1.3 主要仪器设备23
• 2.1.4 羔羊睾丸组织的冷冻与解冻23-24
• 2.1.5 细胞活率、曲细精管完整率测定24
• 2.1.6 睾丸组织的体外培养24
• 2.1.7 睾酮和抑制素释放量测定24
• 2.1.8 数据分析24-25
• 2.2 结果与分析25-28
• 2.2.1 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织细胞活率的影响25
• 2.2.2 DMSO和EG中添加BSA对冻后睾丸组织曲细精管完整性的影响25-26
• 2.2.3 DMSO和EG中添加BSA对冻后睾丸组织睾酮释放量的影响26-27
• 2.2.4 DMSO和EG中添加BSA对冻后睾丸组织抑制素释放量的影响27-28
• 2.3 讨论28-29
• 2.4 小结29-30
• 第三章 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织标志性酶和抗氧化能力的影响30-38
• 3.1 材料与方法31-32
• 3.1.1 羔羊睾丸组织的采集31
• 3.1.2 主要试剂31
• 3.1.3 主要仪器设备31
• 3.1.4 羔羊睾丸组织的冷冻与解冻31
• 3.1.5 睾丸组织的体外培养31
• 3.1.6 睾丸组织悬液的制备31
• 3.1.7 AKP、ACP、LDH、γ-GT、MDA和T-AOC的活性的测定31-32
• 3.1.8 数据分析32
• 3.2 结果与分析32-35
• 3.2.1 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织AKP活性的影响32
• 3.2.2 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织ACP活性的影响32-33
• 3.2.3 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织LDH活性的影响33
• 3.2.4 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织 γ-GT活性的影响33-34
• 3.2.5 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织T-AOC活性的影响34
• 3.2.6 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织MDA活性的影响34-35
• 3.3 讨论35-37
• 3.4 小结37-38
• 第四章 DMSO和EG中添加BSA对冻后羔羊睾丸组织关键基因相对表达量的影响38-46
• 4.1 材料与方法38-41
• 4.1.1 羔羊睾丸组织的采集38
• 4.1.2 主要试剂38-39
• 4.1.3 主要仪器设备39
• 4.1.4 羔羊睾丸组织的冷冻与解冻39
• 4.1.5 睾丸组织的体外培养39
• 4.1.6 总RNA的提取和检测39
• 4.1.7 RNA的反转录39-40
• 4.1.8 引物设计与合成40
• 4.1.9 实时荧光定量PCR40
• 4.1.10 统计分析40-41
• 4.2 结果与分析41-44
• 4.2.1 总RNA提取结果的检测41
• 4.2.2 实时荧光定量结果分析41-42
• 4.2.3 DMSO和EG中添加BSA对羔羊睾丸组织Caspase-3、CD90、GDNF和Oct-4 相对表达量的影响42-44
• 4.3 讨论44-45
• 4.4 小结45-46
• 结论46
• 进一步研究内容46-47
• 参考文献47-54
• 附录54-58
• 缩略词58-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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