Gnα11和Gnαs在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位分析

发布时间：2017-09-26 03:18

  本文关键词：Gnα11和Gnαs在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位分析

  更多相关文章： Gnα11 Gnαs 绵羊 QRT-PCR 免疫荧光

【摘要】：天然的毛色不仅是毛用动物特有的生物学性状,而且还具有很高的经济学价值。G蛋白信号通路在调节动物毛色形成的过程中起着至关重要的作用,其中,Gnα11和Gnas分别是异源三聚体G蛋白α亚基下游中的两个小亚基。在内皮素信号途径中,Gnα11通过内皮素的作用调控毛色的形成,其中内皮素及其受体对黑色素细胞的成熟和分化具有促进作用。在黑皮质素信号路径中,Gnas通过黑色素皮质素途径发挥作用,并调节单个黑色素细胞中不同类型色素的形成。因此,Gnα11和Gnas可能与动物毛色的形成有关。为了探讨Gnα11和Gnas与绵羊毛色形成的关系,本试验通过PCR扩增绵羊皮肤组织的Gnα11和Gnas基因序列,并对其在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位进行研究。试验结果显示：1. RT-PCR扩增得到Gnα11和Gnas的部分基因条带,测序结果与扩增条带大小相符,长度分别为300bp和139bp,说明Gnα11和Gnas均可在绵羊皮肤上正常表达。2. QRT-PCR结果显示,Gnα11mRNA在黑色和白色绵羊皮肤中的相对表达量分别是1.8323±0.0864和1.0955±0.1238,黑色绵羊是白色绵羊的1.7倍；Gnas mRNA在黑色和白色绵羊皮肤中的相对表达量分别是2.8068±0.2343和1.1732±0.1647,黑色绵羊是白色绵羊的2.4倍。以上表明,Gnα11和Gnas在黑色绵羊皮肤中的mRNA表达量均极显著高于白色绵羊(P0.01),说明两者与绵羊毛色的表型有一定的相关性。3. Western blotting结果显示,黑色和白色绵羊皮肤组织总蛋白均可与兔抗Gnα11多克隆抗体和兔抗Gnas多克隆抗体结合并发生免疫阳性反应,两个蛋白分子质量分别约为42 kDa和111 kDa。在黑色和白色绵羊皮肤中,Gnα11蛋白的相对表达量分别是0.4843±0.1292和0.2388±0.0889,黑色绵羊是白色绵羊的2.0倍：Gnas蛋白的相对表达量分别是0.4421±0.0435和0.2678±0.0720,黑色绵羊是白色绵羊的1.7倍,可见Gnα11和Gnas在黑色绵羊皮肤中的蛋白表达量均显著高于白色绵羊(P0.05)。4.免疫组织化学和免疫荧光试验均检测到：Gnα11主要表达于绵羊皮肤组织的毛囊外根鞘组织;Gnas在绵羊皮肤组织的毛囊外根鞘组织和毛乳头都有表达,表明Gnα11和Gnas均可作为标记蛋白参与绵羊毛色的形成。综上所述,Gnα11和Gnas在不同毛色绵羊皮肤组织中均有表达和定位,而且表达量存在一定的差异性,推测Gnα11和Gnas可能与绵羊毛色的形成有关。
【关键词】：Gnα11 Gnαs 绵羊 QRT-PCR 免疫荧光
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要7-9
• 前言9-10
• 文献综述10-24
• 1 黑色素细胞的研究概述10-16
• 1.1 黑色素细胞的起源10-13
• 1.2 黑色素细胞的分类13-16
• 2 黑色素的研究概述16-19
• 2.1 黑色素的分类16-17
• 2.2 黑色素的合成17-19
• 3 G蛋白偶联信号系统的基本结构19-20
• 4 MC1R/Gαs信号通路的结构及功能20-21
• 4.1 MC1R基因结构20
• 4.2 MC1R/Gαs信号通路的功能20-21
• 5 内皮素/Gαq信号通路的结构及功能21-24
• 5.1 内皮素的基本结构21-22
• 5.2 内皮素/Gαq信号通路的功能22-24
• 材料与方法24-35
• 1 试验材料24-27
• 1.1 试验动物及取材24
• 1.2 主要仪器24
• 1.3 主要试剂24-25
• 1.4 主要溶液的配制25-27
• 2 试验方法27-35
• 2.1 Gnα11和Gnαs基因部分序列的克隆及分析27-29
• 2.1.1 皮肤组织总RNA的提取及反转录合成cDNA27
• 2.1.2 PCR引物的设计与合成27-28
• 2.1.3 PCR产物的扩增28-29
• 2.2 QRT-PCR反应29-30
• 2.2.1 QRT-PCR引物的设计29-30
• 2.2.2 QRT-PCR反应体系的建立30
• 2.2.3 QRT-PCR数据分析30
• 2.3 Western blotting30-32
• 2.3.1 绵羊皮肤组织总蛋白的提取30
• 2.3.2 蛋白含量的测定30
• 2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳30-31
• 2.3.4 转膜31-32
• 2.3.5 杂交32
• 2.3.6 显色32
• 2.3.7 Western blotting图像分析及数据处理32
• 2.4 Gnα11和Gnαs蛋白的定位32-35
• 2.4.1 石蜡切片的制备32-33
• 2.4.2 免疫组织化学33-34
• 2.4.3 免疫荧光技术34-35
• 结果与分析35-44
• 1 绵羊Gnα11和Gnαs基因部分序列的克隆及分析结果35-37
• 1.1 总RNA的检测结果35
• 1.2 RT-PCR的扩增产物电泳结果35-36
• 1.3 RT-PCR扩增产物的测序结果36-37
• 2 Gnα11和Gnαs在不同毛色绵羊皮肤组织中的基因表达结果37-39
• 2.1 Gnα11和Gnαs基因的扩增动力学曲线和溶解曲线37-39
• 2.2 Gnα11和Gnαs基因在不同毛色绵羊皮肤中的表达结果39
• 3 Gnα11和Gnαs在不同毛色绵羊皮肤组织中的蛋白表达结果39-41
• 4 Gnα11和Gnαs在不同毛色绵羊皮肤组织中的蛋白定位结果41-44
• 4.1 免疫组织化学定位结果41-43
• 4.2 免疫荧光技术定位结果43-44
• 讨论44-47
• 1 Gnα11在不同毛色绵羊皮肤组织中的表达差异44-45
• 2 Gnαs在不同毛色绵羊皮肤组织中的表达差异45-46
• 3 Gnα11和Gnαs在绵羊皮肤组织中的表达定位46-47
• 全文总结47-48
• 参考文献48-55
• ABSTRACT55-57
• 致谢57

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本文编号：921153