表面蛋白EF3183对致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11部分生物学特性影响的研究

发布时间：2017-09-26 03:27

  本文关键词：表面蛋白EF3183对致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11部分生物学特性影响的研究

  更多相关文章： 致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11 表面蛋白EF3183 同源重组 生物被膜

【摘要】：肠球菌虽然是人类和动物肠道正常菌群的重要组成部分,但在医学临床和兽医临床完全证实具有致病性。肠球菌广泛的致病性除了与其独特的耐药性有关外,众多的毒力因子也发挥着重要作用。在众多毒力因子中其一系列的表面蛋白在细菌对宿主细胞的粘附、定殖以及致病性方面发挥着重要作用。本研究在前期工作基础上,以致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11为亲本株,应用同源重组的方法构建新筛选出的表面蛋白EF3183基因突变株,培养He La及RAW264.7细胞,通过观察突变株对He La细胞的粘附能力和EF3183单抗的粘附抑制、小鼠RAW264.7细胞的侵染能力、小鼠主要脏器的载菌能力以及对BF形成能力的影响。来阐述新筛选的表面蛋白EF3183在XJ11株致病过程中的作用,为进一步阐明粪肠球菌的致病机理提供有用数据。现将试验结果报告如下:1、致羔羊脑炎粪肠球菌表面蛋白基因的检测:根据致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05全基因组测序的结果,设计特异性引物,采用PCR扩增检测表面蛋白EF1092、EF1269、EF2224、EF2505、EF3183在11株致羔羊脑炎粪肠球菌中的分布情况。结果发现五种表面蛋白在11株致羔羊脑炎粪肠球菌中广泛分布,除XJ09只含有EF2224外,其余10株菌中均含有五种表面蛋白。2、致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株EF3183基因的克隆与生物信息学分析:采用PCR方法扩增EF3183基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测期功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长1060 bp的表面蛋白EF3183基因;经生物信息学分析,此序列包含有一个1056 bp的完整开放阅读框,编码351个氨基酸;无信号肽;有2个跨膜区;抗原表位预测显示表面蛋白EF3183有15个抗原表位;系统进化树分析显示致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因与粪肠球菌v583的EF3183基因的进化距离最近。3、致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11-Δ3183突变株的构建:应用同源重组技术构建XJ11的EF3183基因突变株,使用Primer 5设计引物,扩增出用于失活表面蛋白EF3183基因的插入序列,酶切、回收该基因序列,并与酶切后的穿梭质粒进行连接后,电转化至E.faecalis XJ11的感受态细胞中。使用卡那霉素抗性筛选出阳性转化子,并采用PCR等方法进行鉴定。最终成功得到基因突变株E.faecalis XJ11-Δ3183。4、E.faecalis XJ11-Δ3183在细胞粘附、特异性单抗粘附抑制、侵染及脏器载菌量研究:以E.faecalis XJ11为对照组,E.faecalis XJ11-Δ3183为实验组,分别于粘附He La细胞1 h和2 h后裂解细胞,在E.faecalis XJ11粘附He La细胞前加入抗表面蛋白EF3183的单克隆抗体,裂解细胞涂平板后进行细菌计数;于细菌侵染小鼠RAW264.7细胞4 h和24 h后,裂解细胞,涂平板进行细菌计数;在不同时间人工感染小鼠,取肝小叶、脾脏、左肾和心脏组织匀浆,匀浆液稀释后涂平板统计细菌数计算小鼠脏器载菌量。结果显示与野毒株比较,EF3183突变株的对He La细胞粘附数量明显下降,且差异极显著(P0.001)。加入单抗的E.faecalis XJ11对He La细胞粘附数量明显出现下降,且差异极显著(P0.001)。侵染小鼠RAW264.7细胞细菌数量变化不明显,且差异不显著(P0.05)。感染小鼠6 h、12 h和24 h后,突变株在小鼠肝小叶、脾脏、左肾的载菌量下降明显,且差异极显著(P0.01);在心脏的载菌量下降明显,且差异显著(P0.05)。5、E.faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究:将E.faecalis XJ11和E.faecalis XJ11-Δ3183在分别置于37℃条件下于96孔板中培养8 h、18 h、24 h、36 h和48 h,经1%结晶紫染色后,测定各个孔的吸光度。同时用孔底放有盖玻片的六孔板培养细菌,经刀豆蛋白A或PI染色后,将盖玻片取出后用激光共聚焦显微镜下观察生物被膜的形态结构。结果显示E.faecalis XJ11所形成生物被膜的吸光度明显高于E.faecalis XJ11-Δ3183,统计学分析差异显著(P0.05);野毒株生物被膜基质中形成的多糖数量更多且结构致密,其中包埋的细菌呈现区域化的分布,而E.faecalis XJ11-Δ3183在气液交界面形成完整的生物被膜不够完整。
【关键词】：致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11 表面蛋白EF3183 同源重组 生物被膜
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 全文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略词表12-13
• 前言13-14
• 第一章 文献综述14-23
• 1.生态学与流行病学14
• 2.毒力因子14-17
• 2.1 聚合蛋白（AS / Agg）14-15
• 2.2 胞外表面蛋白（Esp）15
• 2.3 微生物表面成分识别粘附基质分子（MSCRAMMs）15
• 2.4 溶细胞素（Cyl）15-16
• 2.5 透明质酸酶（Hyl）16
• 2.6 性信息素（Sex Pheromones）16-17
• 3.耐药特点17-19
• 3.1 β-内酰胺类耐药17
• 3.2 氨基糖苷类耐药17-18
• 3.3 糖肽类耐药18
• 3.4 利奈唑胺耐药18
• 3.5 达托霉素耐药18-19
• 4.生物被膜（BF）19-23
• 4.1 EPS与BF结构19-20
• 4.2 胞外多糖20
• 4.3 胞外蛋白20-21
• 4.4 胞外DNA21
• 4.5 表面活性剂与脂类21-22
• 4.6 水22-23
• 第二章 试验内容23-61
• 试验一 致羔羊脑炎粪肠球菌表面蛋白基因的检测23-29
• 1.材料23-25
• 1.1 样本及菌株来源23-24
• 1.2 试剂24
• 1.3 引物24
• 1.4 仪器24-25
• 1.5 主要缓冲液和试剂的配制25
• 2.方法25
• 2.1 表面蛋白基因的PCR扩增25
• 3.结果25-27
• 3.1 表面蛋白基因的PCR检测25-27
• 4.讨论27-29
• 试验二 致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因的克隆与生物信息学分析29-38
• 1. 材料29-30
• 1.1 样本来源29-30
• 1.2 试剂30
• 2. 方法30-31
• 2.1 引物的设计与合成30
• 2.2 XJ11株羔羊脑炎粪肠球菌表面蛋白EF3183基因的PCR扩增30
• 2.3 致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因的克隆及鉴定30
• 2.4 XJ11株表面蛋白EF3183基因编码蛋白的生物信息学分析30-31
• 2.5 XJ11株表面蛋白EF3183基因的系统进化分析31
• 3. 结果31-37
• 3.1 XJ11株细菌EF3183基因的PCR扩增与鉴定31-32
• 3.2 XJ11株表面蛋白EF3183基因的生物信息学分析32-35
• 3.3 系统进化分析35-37
• 4. 讨论37-38
• 试验三 致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11-Δ3183突变株的构建38-45
• 1. 材料38-40
• 1.1 菌株、质粒38
• 1.2 主要试剂38-39
• 1.3 引物设计与合成39
• 1.4 仪器39
• 1.5 主要缓冲液和试剂的配制39-40
• 2. 方法 (按吴利先方法进行[116])40-42
• 2.1 XJ11培养及基因组DNA提取40
• 2.2 EF3183基因插入片段的PCR扩增及回收纯化40-41
• 2.3 pTX4577-Δ3183的构建41
• 2.4 电转化用E. faecalis XJ11感受态细胞的制备（甘氨酸法）41
• 2.5 电转化41-42
• 2.6 同源重组株的鉴定42
• 3. 结果42-44
• 3.1 EF3183基因插入片段PCR扩增结果42-43
• 3.2 重组质粒pTX4577-Δ3183的双酶切鉴定结果43
• 3.3 突变株的鉴定结果43-44
• 4. 讨论44-45
• 试验四 E. faecalis XJ11-Δ3183在细胞粘附、侵染及脏器载菌量与野毒株的对比研究45-52
• 1. 材料46-47
• 1.1 菌株和实验动物46
• 1.2 主要试剂46
• 1.3 主要仪器46
• 1.4 主要试剂的配置46-47
• 2 方法47-48
• 2.1 HeLa细胞粘附与粘附抑制试验47
• 2.2 RAW264.7 侵染试验47-48
• 2.3 小鼠心、肝、脾、肾载菌量的测定48
• 3. 结果48-50
• 3.1 HeLa细胞粘附与粘附抑制试验48-49
• 3.2 小鼠RAW264.7 细胞侵染试验49
• 3.3 小鼠载菌量测定结果49-50
• 4. 讨论50-52
• 试验五 E. faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究52-61
• 1.材料52-53
• 1.1 菌株52
• 1.2 主要试剂52-53
• 1.3 主要仪器53
• 1.4 主要试剂配置53
• 2.方法53-54
• 2.1 96孔板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay)检测BF形成量53-54
• 2.2 BF形态结构的观察54
• 3.结果54-59
• 3.1 BF形成量的测定结果54-55
• 3.2 BF形态结构的观察55-59
• 4.讨论59-61
• 全文结论61-63
• 参考文献63-72
• 致谢72-73
• 附录73-74
• 作者简历74-75
• 附件75

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