水貂肠炎细小病毒在体内分布规律及相关细胞因子的变化

发布时间：2017-09-26 16:16

  本文关键词：水貂肠炎细小病毒在体内分布规律及相关细胞因子的变化

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【摘要】：水貂病毒性肠炎(Mink parvoviral enteritis),是由水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus MEV)引起的高度接触性传染病,发病水貂的主要临床特征为剧烈腹泻和呕吐等,该病具有较高的发病率和死亡率。随着毛皮动物养殖业的迅速发展,此病也时常爆发,给水貂养殖业造成巨大的经济损失。因此研究水貂肠炎病毒的致病性和免疫相关因子变化对MEV的预防具有重要作用。为检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA,建立了荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank设计引物,通过RT-PCR扩增IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因片段,连接到pMD18-T载体中制备质粒标准品,建立了相应基因mRNA的荧光定量RT-PCR检测方法并建立标准曲线。结果表明:GAPDH、IFN-α和IFN-β和IFN-γ基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL~1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数(R2)均为1.00,熔解曲线均呈单一熔解峰,检测下限为10copies/μL,重复性试验结果表明组内、组间变异系数均小于4.5%。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后,IFN-α、IFN-β和IFNγ相对表达水平均在6d达到最高峰值,IFN-α相对表达量要比IFN-β和IFN-γ相对表达量高,并且在感染期(4d~6d)IFN-α相对表达量明显上调。本研究为水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。为研究水貂肠炎病毒强毒株SMPV-11和弱毒疫苗株MEVB-F61分别感染水貂后,水貂细胞因子的动态变化,现采用已建立并应用的SYBR GreenⅠ染料法荧光定量RT-PCR检测方法,检测不同MEV(SMPV-11和MEVB-F61)感染水貂后,水貂细胞因子的动态变化。检测结果表明:在感染SMPV-11和MEVB-F61病毒后,IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4相对表达量在2d~6d逐渐升高,并且在第6d达到峰值;并且IFN-α、IFN-β、INF-γ和IL-4在10d和15d SMPV-11组的表达量均高于MEVB-F61组;TNF-α的相对表达量与前三者有所差异,在0d~2d mRNA表达量逐渐升高,第2d达到最高值后逐渐下降,在第6d又开始逐渐升高,并且SMPV-11组的表达量也高于MEVB-F61组。本研究为MEV感染水貂后机体外周血细胞因子动态变化的研究提供理论基础。为了研究水貂肠炎病毒感染水貂后病毒在水貂体内的分布情况,设计了两个试验,首先研究水貂细小病毒强毒株SMPV-11口服感染水貂后的病理变化、白细胞变化和病毒在体内不同器官分布情况等;同时另一个试验研究了弱毒疫苗株MEVB-F61注射感染水貂后的病毒在体内不同器官分布规律、白细胞变化。结果表明,SMPV-11感染后,水貂表现出严重的临床特征,如食欲废绝、体温升高及血便等症状,剖检可见肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏肿大有出血点、肠道出血和肠壁变薄等症状,感染24h后,在各组织脏器中可以检测到病毒,并且在4d~6d MEV载量维持较高水平。MEVB-F61感染后,未发现主要的临床症状,剖检未见明显的病理变化特征,病毒载量检测显示,在脑、肾脏和肺脏中未检测到MEV的存在,而且在其它组织中,病毒载量均较低,在第15d心、肝和肠道等脏器中已检测不到MEV。在4d~8d是SMPV-11组和MEVB-F61水貂的排毒量高峰时段,表明此时段是病毒向外界扩散最严重时期,并且两个毒株在肠道和淋巴组织和脾脏中含量最高,印证了肠道、肠系膜淋巴结和脾脏等是MEV主要的靶器官。对MEV在临床特征、病理变化和病毒体内分布的研究,有利于MEV感染水貂的致病机理的进一步研究,也为MEV弱毒疫苗的免疫研究奠定理论基础。
【关键词】：水貂肠炎病毒 细胞因子 白细胞介素 致病机理
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-16
• 第一章 引言16-24
• 1.1 水貂肠炎病毒概述16
• 1.1.1 水貂肠炎病毒病原学16
• 1.2 水貂肠炎病毒分子生物学研究进展16-21
• 1.2.1 MEV的非结构蛋白16-17
• 1.2.2 MEV的结构蛋白17-18
• 1.2.3 MEV的治病机理18
• 1.2.4 MEV的诊断方法18-20
• 1.2.5 MEV疫苗研究进展20-21
• 1.3 细胞因子的研究进展21-23
• 1.3.1 干扰素抗病毒及免疫相关作用21-22
• 1.3.2 白细胞介素抗病毒及免疫相关作用22
• 1.3.3 肿瘤坏死因子抗病毒及免疫相关作用22-23
• 1.4 本研究的目的和意义23-24
• 第二章 水貂干扰素荧光定量检测方法的建立及应用24-33
• 2.1 材料与方法25-26
• 2.1.1 实验动物和毒种25
• 2.1.2 主要试剂和仪器25
• 2.1.3 引物设计与合成25
• 2.1.4 淋巴细胞总RNA提取与cDNA合成25-26
• 2.1.5 质粒标准品的制备26
• 2.1.6 反应条件优化及标准曲线建立26
• 2.1.7 敏感性、重复性和特异性试验26
• 2.1.8 临床样品检测26
• 2.2 结果26-31
• 2.2.1 质粒标准品的制备26-27
• 2.2.2 反应条件的优化27
• 2.2.3 标准曲线的制作27-29
• 2.2.4 敏感性、特异性和重复性试验29-30
• 2.2.5 临床样品检测结果30-31
• 2.3 讨论31-32
• 2.4 本章小结32-33
• 第三章 水貂细小病毒SMPV-11和MEVB-F61感染后细胞因子检测33-40
• 3.1 材料与方法33-36
• 3.1.1 实验动物和毒种33-34
• 3.1.2 主要试剂和仪器34
• 3.1.3 水貂肠炎病毒扩增培养及病毒含量的测定34
• 3.1.4 双阴性动物的筛选34
• 3.1.5 动物分组与攻毒34
• 3.1.6 引物合成34-35
• 3.1.7 血液RNA的提取与cDNA合成35
• 3.1.8 质粒标准品的制备35
• 3.1.9 样品采集与检测35-36
• 3.2 结果36-38
• 3.2.1 TCID50测定及攻毒36
• 3.2.2 质粒标准品的制备36
• 3.2.3 临床样品检测结果36-38
• 3.3 讨论38-39
• 3.3.1 干扰素检测结果38
• 3.3.2 白细胞介素检测结果38
• 3.3.3 肿瘤坏死因子检测结果38-39
• 3.4 本章小结39-40
• 第四章 水貂细小病毒（SMPV-11和MEVB-F61）感染后病毒体内分布40-54
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 实验动物和毒种40
• 4.1.2 主要试剂和仪器40-41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 水貂肠炎病毒扩增培养及病毒含量的测定41
• 4.2.2 双阴性动物筛选41
• 4.2.3 动物分组和攻毒41
• 4.2.4 动物体征观察与样品采集41-42
• 4.2.5 DNA的提取42
• 4.2.6 血清MEV抗体检测42
• 4.2.7 血常规检测42
• 4.2.8 病毒含量检测42-43
• 4.3 结果43-52
• 4.3.1 动物体征变化43
• 4.3.2 发病动物剖检43-44
• 4.3.3 病理切片44-48
• 4.3.4 MEV感染后体温变化情况48
• 4.3.5 水貂抗体水平48-49
• 4.3.6 水貂组织和粪便中MEV含量测定49-51
• 4.3.7 血常规检测结果51-52
• 4.4 讨论52-53
• 4.4.1 动物的临床特性及病理变化52
• 4.4.2 病毒载量和体内分布52
• 4.4.3 血常规变化52-53
• 4.5 本章小结53-54
• 第五章 全文结论54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-62
• 致谢62-63
• 作者简历63

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本文编号：924501