伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建

发布时间：2017-09-27 00:14

  本文关键词：伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建

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【摘要】：伪狂犬病病毒(Pseudorabies viurs,PRV)属疱疹病毒科(Herpesviridae)、α-疱疹病毒亚科(Alpha-herpesviridae),可致多数动物感染发病,并能引起猪的潜伏感染。猪是其主要宿主和病毒携带者,对养猪业的发展危害重大。在2011年之前,由于PRV gE缺失疫苗的广泛使用,国内的PRV疫情得到了很好的控制,但从2011年底开始,PRV疫情突然大面积爆发,传统的gE缺失疫苗已被证实无法提供完全有效的免疫保护,使得国内养猪业面临巨大的威胁。本研究对PRV新流行毒株进行了分离鉴定,并对其主要糖蛋白的分子特征进行了分析;模仿PRV Bartha株的gE缺失区域,构建了PRV新流行毒株的gE缺失转移质粒,为新流行毒株gE缺失突变株的构建奠定了基础。具体研究内容如下:1、伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定从安徽某免疫PRV Bartha K61疫苗猪场送检的流产胎儿中采集脑、心、肝、脾、肺、肾,经PCR扩增,结果从脑、肝、脾、肺中检测到PRV gE基因阳性。将脑组织研磨后接种BHK-21细胞,在37℃5%CO_2培养箱培养48h后,细胞出现了明显的细胞病变,病变细胞经PCR检测为PRV gE阳性;采用空斑纯化方法纯化了该病毒,并命名为PRV AH-China-2013。将病毒接种昆明小鼠,通过LD_(50)测定评价了该病毒对小鼠的致病性,结果表明其LD_(50)为10~(4.15)TCID_(50)。2、伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析提取PRV AH-China-2013基因组,采用PCR扩增其主要糖蛋白基因g B、g C、g D、gE,经测序后,将g C、gE基因分别与国内外不同年代分离的PRV毒株进行序列比对,通过mega5.0绘制PRV AH-China-2013株g C和gE基因的遗传进化树;通过PRV AH-China-2013 g B、g C、g D、gE序列推导其氨基酸序列,并与国内外不同年代分离的PRV毒株相应糖蛋白序列进行比对分析。遗传进化分析结果显示,PRV AH-China-2013株与国内毒株(除2008年分离的7株毒株外)位于同一个分支,且与2011年来新分离毒株的遗传关系更近,而与与国外毒株及疫苗毒株Bartha株遗传关系较远,表明PRV AH-China-2013株属于PRV新流行毒株。氨基酸序列比对结果显示,与国外毒株相比,国内株主要糖蛋白均存在明显的氨基酸的缺失或插入,且部分突变位点位于相应蛋白的关键功能域内,这些突变是否导致病毒毒力及免疫原性的改变,进而影响现有疫苗的免疫效果,尚需进一步证实。3、伪狂犬病病毒新流行株gE缺失转移质粒的构建根据新流行毒株PRV-ZJ01的基因组序列,在gE基因上、下游设计长度分别为838bp和961bp的基因片段作为同源重组的同源臂,即同源左臂LA和同源右臂RA;以p EGFP质粒为模板,设计引物扩增包含完整表达盒的绿色荧光蛋白基因EGFP作为标记基因。通过酶切、连接、转化等方法,并按照LA-EGFP-RA的顺序,将LA、RA、EGFP连接到T载体的多克隆位点,构建PRV gE缺失转移质粒,经测序正确的质粒命名为p MD-LA-EGFP-RA。将构建好的转移质粒p MD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞,通过荧光显微镜观察,结果显示转染细胞中可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达,表明构建的转移质粒可以用于后续同源重组试验。本研究从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据;成功构建了PRV新流行株的gE缺失转移质粒,为gE缺失突变株的构建及新疫苗的研制奠定了一定的基础。
【关键词】：伪狂犬病病毒 流行毒株 主要糖蛋白 分子特征分析 转移质粒构建
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-19
• 1.1 伪狂犬病的流行病学11
• 1.2 我国伪狂犬病的流行现状11-12
• 1.3 病原学12
• 1.3.1 病毒的结构12
• 1.3.2 病毒的理化特性12
• 1.4 病毒的传染特点12-13
• 1.4.1 潜伏感染12
• 1.4.2 隐性感染12-13
• 1.4.3 显性感染13
• 1.5 伪狂犬病毒的致病机理13
• 1.6 伪狂犬病的诊断方法13-15
• 1.6.1 动物接种试验13-14
• 1.6.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)14
• 1.6.3 免疫荧光试验(FA)14
• 1.6.4 聚合酶链式反应（PCR）14-15
• 1.6.5 基因芯片技术15
• 1.7 伪狂犬病的防控15-16
• 1.7.1 自繁自养15
• 1.7.2 疫苗免疫15-16
• 1.7.3 加强饲养管理16
• 1.8 病毒重组涉及的研究方法16-18
• 1.8.1 同源重组技术16-17
• 1.8.2 融合PCR技术17
• 1.8.3 外源基因转染细胞技术17-18
• 1.8.4 病毒空斑技术18
• 1.9 研究的目的和意义18-19
• 2 材料与方法19-37
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 细胞、菌种、质粒和动物19
• 2.1.2 酶类相关试剂19
• 2.1.3 细胞培养用溶液19-20
• 2.1.4 病毒DNA抽提相关溶液20
• 2.1.5 细菌培养基及常用溶液20
• 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳缓冲液20
• 2.1.7 主要仪器设备20-21
• 2.2 方法21-37
• 2.2.1 PRV AH-China-2013的分离与鉴定21-23
• 2.2.2 PRV AH-China-2013株的空斑纯化与TCID_(50)的测定23-24
• 2.2.3 PRV AH-China-2013的致病性实验24
• 2.2.4 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因片段的克隆与鉴定24-26
• 2.2.5 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因序列测序结果的分析26
• 2.2.6 PRV AH-China-2013 gE缺失转移质粒的构建26-27
• 2.2.7 绿色荧光蛋白基因EGFP的PCR扩增27-28
• 2.2.8 转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建与表达28-31
• 2.2.9 重组质粒pMD-LA-RA的构建31-33
• 2.2.10 转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建33-35
• 2.2.11 转移质粒pMD-LA-EGFP-RA基因的表达检测35-37
• 3 结果与分析37-53
• 3.1 PRV的分离与鉴定37-39
• 3.1.1 疑似病料的PCR扩增结果37
• 3.1.2 病料接种细胞产生的细胞病变37-38
• 3.1.3 病变细胞的PCR检测38-39
• 3.2 PRV的空斑纯化与致病性实验39-41
• 3.2.1 PRV的空斑纯化39
• 3.2.2 PRV AH-China-2013 TCID_(50)的测定39-40
• 3.2.3 PRV AH-China-2013的致病性实验40-41
• 3.3 PRV AH-China-2013的遗传进化与分子特征分析41-49
• 3.3.1 PRV AH-China-2013主要糖蛋白基因的PCR扩增41-43
• 3.3.2 PRV AH-China-2013的遗传进化分析43-46
• 3.3.3 PRV AH-China-2013主要糖蛋白的分子特征分析46-49
• 3.4 PRV AH-China-2013 gE缺失转移质粒的构建49-53
• 3.4.1 同源臂LA和RA的PCR扩增结果49-50
• 3.4.2 EGFP基因表达盒的PCR扩增结果50-51
• 3.4.3 重组质粒pMD-LA的酶切鉴定结果51
• 3.4.4 重组质粒pMD-LA-RA的酶切鉴定结果51-52
• 3.4.5 转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鉴定结果52-53
• 3.4.6 转移质粒pMD-LA-EGFP-RA中EGFP基因的表达检测53
• 4 讨论与结论53-59
• 4.1 讨论53-57
• 4.1.1 我国猪伪狂犬病的流行趋势53-54
• 4.1.2 PRV Bartha-K61疫苗免疫失败的原因分析54-55
• 4.1.3 PRV AH-China-2013主要糖蛋白的突变分析55-57
• 4.1.4 伪狂犬病病毒新流行毒株基因缺失疫苗的研究策略57
• 4.2 结论57-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-63
• 附录A：荧光质粒pEGFP-N1的图谱63-64
• 附录B：pMD18-T质粒图谱64-65
• 附录C：PRV-AH株gB、gC、gD、gE糖蛋白的基因序列65-69

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本文编号：926554