新疆巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白的体外生物学功能研究

发布时间：2017-09-29 03:13

  本文关键词：新疆巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白的体外生物学功能研究

  更多相关文章： 短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 绵羊肺炎支原体 抑菌活性 中性粒细胞弹性蛋白酶 细胞凋亡

【摘要】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)是特异高表达于呼吸道中的一种分泌蛋白,参与机体免疫防御功能,具有抗感染、清除有害微生物、抑癌、抗肿瘤的作用。SPLUNC1作为一种天然保护性免疫蛋白,对维持上呼吸道的正常生理活动起着重要作用。但目前对SPLUNC1的研究多集中在人和小鼠上,未见绵羊SPLUNC1基因功能研究报导。目的:本实验在成功表达巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白(rSPLUNC1)的基础上,对rSPLUNC1进行了蛋白纯化及western blot检测,并进一步研究rSPLUNC1对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)增殖的影响、对部分病原菌抑菌活性的影响、对中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)活性的调节作用及诱导感染细菌的外周淋巴细胞凋亡的影响,为研究rSPLUNC1的生物学功能奠定基础。方法:(1)rSPLUNC1的纯化及Western blot检测:利用课题组已构建好的巴什拜羊重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-SPLUNC1阳性克隆株,甲醇诱导表达96h,采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,Western blot方法检测目的蛋白的表达。(2)rSPLUNC1对Mo增殖的影响:采用平板菌落计数和实时荧光定量PCR两种方法检测3种不同浓度rSPLUNC1(10μg/mL、20μg/m L、40μg/m L)对Mo菌落生长及Mo 16S rRNA增殖的影响。用体视显微镜观察计数单菌落观察菌落生长情况,并利用荧光定量PCR检测Mo 16S rRNA的拷贝数。(3)rSPLUNC1对肺部病原菌的抑菌活性:采用微量稀释法测定不同溶度rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml)对巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌4种菌的抑菌活性。在96孔板内将rSPLUNC1与测试菌培养,分别在0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h测定菌液的OD600。(4)rSPLUNC1对NE活性的调节作用:用显色底物法检测3种不同浓度的rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml)对NE活性的调节作用。将中性粒细胞与Mo和rSPLUNC1共同培养2h,再于96孔板加入2 mmol/L四肽底物37℃孵育5min后用酶标仪测定OD405nm值。(5)rSPLUNC1对外周淋巴细胞凋亡的影响:将淋巴细胞分别感染Mo、巴氏杆菌、肺炎链球菌3种呼吸道病菌,再加入rSPLUNC1,利用荧光双染法检测淋巴细胞凋亡情况,进一步用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的DNA Ladder。结果和结论:(1)rSPLUNC1经纯化后,杂蛋白大大减少,SDS-PAGE分析可见蛋白分子量大小为25.53kDa的目的条带;Western Blot检测发现可以与抗His标签的鼠单克隆抗体特异性结合的目的条带,蛋白条带单一,大小为25.53Kda,说明表达的蛋白为目的蛋白。(2)平板菌落计数中,10μg/mL、20μg/mL、40μg/m L rSPLUNC1浓度组菌落数分别比对照组减少37.25%(p0.01)、48.74%(p0.01)、67.23%(p0.01);荧光定量PCR中,自2 h起,实验组Mo 16S rRNA拷贝数降低,4 h时拷贝数最低,10μg/m L、20μg/m L、40μg/mL rSPLUNC1浓度组的拷贝数比对照组降低2.96%(p0.05)、92.57%(p0.01)、93.75%(p0.01)。研究表明,rSPLUNC1对体外培养的Mo具有显著的抑制作用。(3)rSPLUNC1极显著抑制巴氏杆菌、大肠杆菌的生长,在设定浓度内(10-40μg/ml)且呈剂量效应,而对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的生长没有抑制效果。说明rSPLUNC1能够抑制巴氏杆菌等革兰氏阴性菌。(4)10μg/ml rSPLUNC1显著提高Mo感染的外周中性粒细胞NE的活性(p0.05),20~40μg/ml rSPLUNC1极显著地提高Mo感染的外周中性粒细胞NE的活性(p0.01,p0.01)。说明rSPLUNC1能够调节NE活性,对抗呼吸道感染具有重要意义。(5)采用荧光双染法未见有细胞凋亡的绿色荧光信号,琼脂糖凝胶电泳检测也未见细胞凋亡的特征性DNA Ladder条带。说明SPLUNC1没有诱导感染病原菌的淋巴细胞发生凋亡。
【关键词】：短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1 巴什拜羊 绵羊肺炎支原体 抑菌活性 中性粒细胞弹性蛋白酶 细胞凋亡
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 主要缩略词10-14
• 引言14-15
• 第一章 文献综述15-25
• 1 SPLUNC1的研究进展15-17
• 1.1 SPLUNC1的发现及分布15
• 1.2 SPLUNC1的分子结构和作用机理15-16
• 1.3 SPLUNC1的生物学功能16-17
• 2 巴什拜羊的生物学特性17-18
• 3 蛋白质分离与纯化技术研究进展18-20
• 3.1 根据蛋白质的物理特性进行分离纯化的技术18-19
• 3.2 根据蛋白质的生物学特性进行分离纯化的技术19
• 3.3 其他分离纯化技术19-20
• 4 中性粒细胞弹性蛋白酶的研究进展20-21
• 4.1 NE的生物学特点20
• 4.2 NE与疾病的关系20-21
• 4.3 NE的检测方法21
• 5 细胞凋亡的研究进展21-25
• 5.1 细胞凋亡的信号传导途径及调控21-23
• 5.2 细胞凋亡引起的细胞变化23
• 5.3 细胞凋亡的检测途径23-25
• 第二章 rSPLUNC1的表达及纯化25-32
• 1 材料与方法26-29
• 1.1 实验菌株26
• 1.2 实验试剂26
• 1.3 实验仪器26
• 1.4 培养基及其他试剂配制26-28
• 1.5 实验方法28-29
• 2 结果29-31
• 2.1 rSPLUNC1的SDS-PAGE检测29-30
• 2.2 rSPLUNC1的纯化SDS-PAGE检测30
• 2.3 rSPLUNC1的Western blot鉴定30-31
• 3 讨论31-32
• 第三章 rSPLUNC1对体外培养的Mo生长的影响32-44
• 1 材料与方法32-37
• 1.1 实验材料32-33
• 1.2 平板菌落计数测定rSPLUNC1对Mo菌落生长的影响33
• 1.3 实时荧光定量PCR检测rSPLUNC1对Mo 16sRNA增殖的影响33-37
• 1.4 数据处理37
• 2 结果37-42
• 2.1 平板菌落计数结果37-38
• 2.2 Mo 16SrRNA基因扩增结果38-39
• 2.3 质粒PCR结果39
• 2.4 标准曲线的建立39-41
• 2.5 Mo 16SrRNA定量结果分析41-42
• 3 讨论42-44
• 第四章 rSPLUNC1对呼吸道致病菌的抑制作用44-49
• 1 材料与方法44-45
• 1.1 主要实验菌株44-45
• 1.2 主要试剂、材料及仪器45
• 1.3 rSPLUNC1对细菌的抑制作用45
• 1.4 数据处理45
• 2 结果45-48
• 2.1 rSPLUNC1对巴氏杆菌（Pm）的抑菌效果45-46
• 2.2 rSPLUNC1对大肠杆菌（E.coli）的抑菌效果46-47
• 2.3 rSPLUNC1对肺炎链球菌（Sp）的抑菌效果47
• 2.4 rSPLUNC1对金黄色葡萄球菌（Sa）的作用47-48
• 3 讨论48-49
• 第五章 rSPLUNC1对中性粒细胞弹性蛋白酶的影响49-54
• 1 材料与方法49-51
• 1.1 实验材料49-50
• 1.2 rSPLUNC1对NE活性的调节作用50-51
• 1.3 数据处理51
• 2 结果51-52
• 2.1 标准曲线的建立51-52
• 2.2 rSPLUNC1对NE活性的调节作用52
• 3 讨论52-54
• 第六章 rSPLUNC1对淋巴细胞凋亡的影响54-60
• 1 材料与方法54-56
• 1.1 实验材料54-55
• 1.2 实验方法55-56
• 1.3 数据处理56
• 2 结果56-58
• 2.1 DNA ladder检测凋亡结果56-57
• 2.2 Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测结果57-58
• 3 讨论58-60
• 全文总结60
• 创新点60-61
• 参考文献61-71
• 致谢71-72
• 作者简介72-73
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表73

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘武军;余雄;李建华;王旭光;赵福宾;马杰;赵泽;;巴什拜羊春季牧食行为研究[J];新疆农业科学;2008年01期

2 依明·苏来曼;;新疆巴什拜羊经济效益分析[J];现代畜牧兽医;2008年06期

3 ;巴什拜羊的由来[J];新疆畜牧业;2010年03期

4 海拉提·库尔曼;提力克;;巴什拜羊几种表型性状及其利用[J];草食家畜;2011年02期

5 决肯·阿尼瓦什;克木尼斯汗;海拉提;季文凭;杜曼;;巴什拜羊瘦肉型新品系的培育及其生产性能分析[J];新疆农业科学;2010年02期

6 ;巴什拜羊标准[J];新疆畜牧业;1990年01期

7 才蔡;;裕民县巴什拜羊走进内蒙古大草源[J];山西农经;2008年02期

8 克木尼斯汉·加汉;决肯·阿尼瓦什;;巴什拜羊羔羊体重增长规律的研究[J];草食家畜;2010年03期

9 克木尼斯汉·加汉;决肯·阿尼瓦什;;引入1/4野盘羊血的瘦肉型巴什拜羊羔羊产瘦肉性能的初步研究[J];黑龙江畜牧兽医;2010年17期

10 海拉提·库尔曼;依明·苏来曼;杜曼;闫京阳;决肯·阿尼瓦什;;巴什拜羊与野生盘羊后代杂种的适应性分析[J];新疆农业大学学报;2012年02期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 韩业东;决肯·阿尼瓦什;帕娜尔;李齐发;谢庄;;巴什拜羊群体遗传多样性与遗传分化的研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年

2 孟庆龙;李曰俊;敬兵;师骏;冯晓军;;塔里木盆地西部巴什托普断裂的主要特征及其油气勘探意义[A];中国科学院地质与地球物理研究所2008学术论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 本报记者　王慧敏;巴什拜羊回来了[N];人民日报;2005年

2 本报记者 庞旭民 整理;裕民之子——巴什拜[N];塔城报;2008年

3 本报记者 李明胜;爱国民主典范巴什拜[N];塔城日报(汉);2011年

4 记者 李明胜;科技引领巴什拜羊产业蓬勃发展[N];塔城日报(汉);2012年

5 记者 李建华;我区巴什拜羊示范区项目建设初见成效[N];塔城报;2007年

6 记者 范春海;巴什拜羊成裕民名牌[N];塔城报;2007年

7 通讯员 李明胜;裕民巴什拜羊大出风头[N];伊犁日报(汉);2008年

8 记者纪洲;裕民县做大做强巴什拜羊产业[N];新疆日报(汉);2009年

9 本报记者 纪洲;走出新疆的巴什拜羊[N];新疆日报(汉);2009年

10 记者 庞旭民 李明胜;裕民巴什拜羊尾巴变小了[N];塔城报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 冷青文;盘羊和巴什拜羊MHC-DRB1、DRB3基因多态性与绵羊肺炎支原体感染相关性研究[D];石河子大学;2015年

2 决肯·阿尼瓦什;巴什拜羊生物学特性及其遗传多样性研究[D];南京农业大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 张晓丽;新疆巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白的体外生物学功能研究[D];石河子大学;2016年

2 邵勇钢;新疆巴什拜羊血液生理生化指标与体重相关性的研究[D];新疆农业大学;2001年

3 韩业东;巴什拜羊微卫星位点的遗传多样性及其与体重体尺的相关性研究[D];南京农业大学;2009年

4 柳春云;塔里木盆地巴什托油气田石炭系储层预测[D];西安石油大学;2011年

，

本文编号：939642