马流产沙门氏菌鞭毛蛋白fljB的原核表达及免疫原性分析

发布时间：2017-09-29 13:34

  本文关键词：马流产沙门氏菌鞭毛蛋白fljB的原核表达及免疫原性分析

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【摘要】：马流产沙门氏菌病又称马副伤寒(equine paratyphoid),是由马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)引起马属动物流产的传染病,同时该病还可引起公马关节突出和马驹的腹泻。马属动物感染本病后会成为该病的携带者,继而还会成为其他疾病的感染源。马流产沙门氏菌的II相鞭毛蛋白fljB,可构成鞭毛抗原(H抗原),该鞭毛蛋白对该菌在机体内的侵袭及扩散起到了关键作用,侵袭宿主后会导致机体产生强烈的免疫应答。本研究利用本实验室分离鉴定的马流产沙门氏菌新疆分离株,根据Genbank上已发表的fljB基因序列,设计一对特异性引物,扩增fljB基因并测序,利用生物软件对fljB进行序列分析,结果表明,马流产沙门氏菌新疆分离株fljB基因序列与已发表马流产沙门氏菌株同源性很高。将fljB基因片段克隆至pET-28a载体中,经酶切鉴定,成功构建原核重组体pET-28a-fljB,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达并纯化后,重组蛋白fljB经SDS-PAGE检测表明,该重组蛋白分子量约为42 kD。Western blotting检测显示,其可与马流产沙门氏菌全菌血清反应,表现出良好的抗原性。将纯化的fljB蛋白免疫小鼠,特异性抗体滴度可达到1∶64000。本实验成功克隆马流产沙门氏菌鞭毛蛋白flj B,构建了pET-28a-fljB原核重组体,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠产生良好的体液免疫,初步验证了重组表达的马流产沙门氏菌fljB鞭毛蛋白具有良好的免疫原性,为今后利用该蛋白进行相关研究奠定基础。
【关键词】：马流产沙门氏菌 fljB基因克隆 原核表达 免疫原性分析
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 英文缩略词表9-10
• 第1章 绪论10-22
• 1.1 沙门氏菌的介绍10-11
• 1.2 马流产沙门氏菌病的症状及流行病学特点11-12
• 1.3 马流产沙门氏菌特征12
• 1.4 马流产沙门氏菌毒力和致病性12-15
• 1.4.1 毒力岛12-14
• 1.4.2 内毒素和外毒素14
• 1.4.3 菌毛14-15
• 1.5 沙门氏菌鞭毛蛋白15-17
• 1.6 鞭毛蛋白的免疫原性17-19
• 1.7 马流产沙门氏菌病的预防和控制19-21
• 1.8 研究意义21-22
• 第2章 马流产沙门氏菌鞭毛蛋白fljB的克隆及序列分析22-30
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 菌种与质粒22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 主要仪器23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 细菌的培养23
• 2.2.2 分离菌基因组的提取23-24
• 2.2.3 引物的合成24
• 2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）24
• 2.2.5 fljB的PCR产物回收24-25
• 2.2.6 载体质粒的提取25
• 2.2.7 pET-28a-fljB表达载体构建25-26
• 2.2.8 细菌的转化26
• 2.2.9 pET-28a-fljB重组质粒的鉴定26
• 2.2.10 XJMS-97株fljB基因序列分析26-27
• 2.3 实验结果27-28
• 2.3.1 fljB基因的PCR扩增27
• 2.3.2 重组质粒pET-28a-fljB双酶切鉴定27
• 2.3.3 不同沙门氏菌fljB的同源性分析和遗传进化分析27-28
• 2.4 讨论28-30
• 第3章 马流产沙门氏菌鞭毛蛋白fljB的原核表达与纯化30-36
• 3.1 材料30
• 3.1.1 菌株与质粒30
• 3.1.2 主要试剂30
• 3.2 实验方法30-33
• 3.2.1 fljB重组体的转化30-31
• 3.2.2 fljB蛋白的诱导表达、纯化及诱导时间的优化31
• 3.2.3 fljB重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）31-32
• 3.2.4 fljB目的蛋白的纯化32
• 3.2.5 Western blotting32-33
• 3.3 实验结果33-35
• 3.3.1 fljB重组蛋白表达产物的SDS-PAGE检测结果33
• 3.3.2 目的蛋白的纯化结果33-34
• 3.3.3 Western blotting分析结果34-35
• 3.4 讨论35-36
• 第4章 马流产沙门氏菌鞭毛蛋白fljB多克隆抗体的制备36-41
• 4.1 材料36-37
• 4.1.1 蛋白及实验动物36
• 4.1.2 主要试剂36
• 4.1.3 主要仪器36-37
• 4.2 实验方法37-38
• 4.2.1 抗原乳化37
• 4.2.2 实验动物免疫37
• 4.2.3 免疫小鼠血清中fljB抗体的检测37-38
• 4.3 实验结果38-39
• 4.4 讨论39-41
• 第5章 结论41-42
• 参考文献42-53
• 致谢53-54
• 作者简介54

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本文编号：942315