小尾寒羊ANKRD2基因的克

发布时间：2017-09-30 19:06

  本文关键词：小尾寒羊ANKRD2基因的克隆、结构特征与表达分析

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【摘要】：锚定重复蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三个保守的成员组成:心肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和锚定重复蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本试验根据实验室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组测序数据,对两个转录本差异表达基因进行筛选,挖掘到差异表达基因ANKRD2为本研究的目的基因。ANKRD2基因特异性表达于骨骼肌,在骨骼肌生长发育过程中起重要作用,参与肌细胞的分化与肌纤维的形成和成熟。目前关于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子结构和组织表达尚未见报道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全长cDNA序列并对其编码的蛋白进行了一系列的生物信息学分析,在mRNA水平和蛋白水平上对小尾寒羊和杜泊羊的组织表达进行了分析。主要研究结果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全长cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全长1179 bp,包含990 bp的开放阅读框、21 bp的5′非编码区(5′UTR)和168 bp的3′非编码区(3′UTR)。其中,开放阅读框编码329个氨基酸的多肽链。我们克隆该基因并将其提交在Genbank上,登陆号是KR090892。在NCBI上下载该基因的预测序列,与我们克隆的序列进行比对,发现相似率约99.40%,CDS区存在2个碱基突变位点。(2)生物信息学分析显示,ANKRD2基因编码的蛋白分子量为36.7 kDa,脂溶指数为87.48(60),蛋白的流动性较大。不稳定指数为49.57(40),蛋白的稳定性一般。疏水性指数为-0.6,说明它为水溶性蛋白,且亲水性较好。等电点为5.72,为偏酸性蛋白,氨基酸组分最多的是谷氨酸。预测蛋白质的二级结构是α螺旋和无规则卷曲。生物信息学软件分析发现其C值、S值和Y值均小于0.5,推断其不含有蛋白信号肽,属于非跨膜蛋白,故不能被分泌到细胞外发挥作用。在氨基酸序列中,发现14个磷酸化位点,12个泛素化位点,10个糖基化位点,4个锚定重复结构域。利用Swiss-model软件预测发现模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)与我们所研究的蛋白拥有最相似的三级结构。(3)将获得的小尾寒羊该基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析,发现小尾寒羊ANKRD2氨基酸与所选物种的相似性均在86%以上,说明该蛋白在哺乳动物中高度保守,系统进化树分析发现绵羊的遗传距离与山羊、牛、马相距较近,与人类、猪、鼠、虎鲸的遗传距离相距较远。(4)通过荧光定量PCR和Western-blot技术分析该基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的组织间的表达情况,发现该基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈现出组织表达差异性。研究发现该基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表达,在骨骼肌中的表达量最高,显著高于其他组织(p0.05)。此外,在骨骼肌组织中,杜泊羊ANKRD2蛋白表达量显著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他组织中,蛋白表达量无显著差异。综上所述,本研究从mRNA水平和蛋白水平对小尾寒羊ANKRD2基因展开了较为系统的研究,并且验证了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同组织中的表达情况,为地方品种小尾寒羊经济性状的改良和分子育种提供理论依据。
【关键词】：小尾寒羊 ANKRD2 克隆和序列分析 组织表达
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 哺乳动物肌纤维类型对骨骼肌的影响12-14
• 1.1.1 肌纤维的类型12
• 1.1.2 肌纤维类型与肌肉产量的关系12-14
• 1.2 骨骼肌的形成及分化机制14-15
• 1.2.1 骨骼肌的组成14
• 1.2.2 骨骼肌的形成和分化机制14-15
• 1.3 ANKRD2基因的研究进展15-17
• 1.4 小尾寒羊和杜泊羊的品种特征及生长性能比较17-18
• 1.4.1 品种特征比较17
• 1.4.2 生长性能比较17-18
• 1.5 本研究的目的及意义18-19
• 2 材料与方法19-43
• 2.1 试验材料19-23
• 2.1.1 试验动物与样品采集19
• 2.1.2 主要试剂与来源19-20
• 2.1.3 主要仪器及来源20-21
• 2.1.4 常用试剂的配制21-23
• 2.2 试验方法23-43
• 2.2.1 基因筛选、引物设计23-24
• 2.2.2 总RNA的提取、检测及cDNA合成24-26
• 2.2.3 小尾寒羊ANKRD2基因克隆测序26-37
• 2.2.4 生物信息学分析和系统进化分析37-38
• 2.2.5 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2基因的荧光定量PCR分析38-39
• 2.2.6 小尾寒羊和杜泊羊ANKRD2蛋白的免疫印迹分析39-43
• 3 结果与分析43-64
• 3.1 克隆测序与核苷酸序列分析43-48
• 3.1.1 总RNA的提取43
• 3.1.2 ANKRD2基因特异性片段的扩增及测序43-44
• 3.1.3 ANKRD2基因 3' RACE扩增及其测序44-45
• 3.1.4 ANKRD2基因 5' RACE扩增及其测序45-46
• 3.1.5 cDNA序列分析46-47
• 3.1.6 预测序列与克隆所得序列进行比对47
• 3.1.7 ANKRD2基因CpG岛预测及甲基化分析47-48
• 3.2 氨基酸序列分析与蛋白的功能预测48-55
• 3.2.1 蛋白的基本性质48-49
• 3.2.2 蛋白的二级结构预测49-50
• 3.2.3 蛋白信号肽预测50-51
• 3.2.4 蛋白磷酸化位点预测51-52
• 3.2.5 蛋白糖基化位点预测52-53
• 3.2.6 蛋白泛素化预测53-54
• 3.2.7 蛋白结构域预测54-55
• 3.2.8 蛋白三级结构预测55
• 3.3 蛋白氨基酸序列的同源性和系统进化分析55-57
• 3.3.1 多物种骨骼肌锚定重复蛋白基因氨基酸序列的同源性比对55-56
• 3.3.2 多物种骨骼肌锚定重复蛋白基因氨基酸序列的系统进化分析56-57
• 3.4 小尾寒羊与杜泊羊ANKRD2基因mRNA的组织特异性表达分析57-61
• 3.4.1 荧光定量PCR标准曲线的建立与分析57-59
• 3.4.2 荧光定量PCR扩增的熔解曲线分析59-60
• 3.4.3 骨骼肌锚定重复蛋白基因mRNA在不同组织中的表达分析60-61
• 3.5 小尾寒羊与杜泊羊骨骼肌锚定重复蛋白的组织特异性表达分析61-64
• 3.5.1 蛋白组织表达的Western-blot结果61-62
• 3.5.2 蛋白在不同组织中的表达特点分析62-64
• 4 讨论64-68
• 4.1 ANKRD2结构与功能关系64-65
• 4.2 ANKRD2氨基酸序列进化分析65-66
• 4.3 ANKRD2基因mRNA表达及功能分析66
• 4.4 ANKRD2蛋白表达及功能分析66-68
• 5 结论68-69
• 参考文献69-76
• 附录76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赵晓;莫德林;张悦;龚雯;李安宁;陈瑶生;;猪的骨骼肌生长发育研究进展[J];生命科学;2011年01期

2 蒋瑶;陈其兵;;植物CBF1转录因子的生物信息学分析[J];林业科学;2010年06期

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本文编号：949878