猪鼻支原体表面可变蛋白家族介导黏附宿主细胞能力研究

发布时间：2017-10-03 22:00

  本文关键词：猪鼻支原体表面可变蛋白家族介导黏附宿主细胞能力研究

  更多相关文章： 猪鼻支原体 可变脂蛋白(vlp) 细胞黏附

【摘要】：猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与了黏附宿主细胞过程,本研究主要详细研究vlp7个家族成员的黏附宿主细胞功能,特别是其Ⅲ区重复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。根据GenBank中已公布的vlp各个家族的基因序列,设计引物,利用PCR扩增获得vlp基因,或者人工合成Ⅲ区重复片段重复次数不等的一系列vlp基因,均克隆于pET-32a(+)进行表达,获得目的蛋白。同时利用固相合成法分别制备vlp各个家族的Ⅲ区重复肽段。用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验鉴定系列vlp重组蛋白和肽段的黏附功能。通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的各个目的重组蛋白。利用间接免疫荧光试验证实了vlp各家族混合蛋白vlpmix参与介导猪鼻支原体黏附宿主细胞；利用微孔板黏附试验定量检测vlp各个家族不含Ⅲ区肽段和含有重复次数为3、6、9、12次的vlp重组蛋白,以及Ⅲ区重复肽段的黏附能力,结果表明Ⅱ区中含有明显的黏附表位,vlpB和vlpG家族的Ⅲ区重复肽段有明显黏附功能,其他家族Ⅲ区重复肽段没有明显黏附功能；vlp各家族的黏附能力都与其Ⅲ区重复次数有关,且随着重复次数增多,黏附能力下降。本研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。
【关键词】：猪鼻支原体 可变脂蛋白(vlp) 细胞黏附
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要8-9
• 文献综述9-14
• 1 猪鼻支原体研究进展9-11
• 1.1 形态特征9
• 1.2 培养特征9-10
• 1.3 猪鼻支原体的致病机制10-11
• 2 猪鼻支原体表面可变脂蛋白家族——vlp家族11-13
• 2.1 支原体表面可变蛋白与细胞黏附12-13
• 2.2 蛋白重复序列区重复次数的变化可能与功能有关13
• 3 本研究的创新点和实践意义13-14
• 3.1 创新和特色13
• 3.2 科学和实践意义13-14
• 试验一 猪鼻支原体vlp各家族混合蛋白黏附细胞实验14-27
• 1 引言14-15
• 2 试验材料15-19
• 2.1 细胞和菌种15
• 2.2 主要试剂15
• 2.3 主要仪器15
• 2.4 主要溶液配制15-19
• 3 试验方法19-21
• 3.1 猪鼻支原体重组蛋白vlpX的表达和纯化19-20
• 3.2 混合重组蛋白vlpmix黏附STEC细胞试验20-21
• 4 结果与分析21-26
• 4.1 重组蛋白vlpX重组蛋白的表达和纯化21-22
• 4.2 重组蛋白的Western Blot鉴定22-23
• 4.3 混合重组蛋白vlpmix黏附STEC和PK-15细胞试验23-26
• 5 小结26-27
• 试验二 猪鼻支原体表面可变蛋白vlp参与介导黏附宿主细胞功能区域鉴定27-37
• 1 引言27
• 2 试验材料27-28
• 2.1 菌株及人工合成短肽27
• 2.2 主要试剂27
• 2.3 主要仪器27-28
• 2.4 主要溶液及配制28
• 3 试验方法28-34
• 3.1 7种不含Ⅲ区重复片段的重组蛋白vlpX0的构建28-32
• 3.2 重组蛋白vlpXO的表达和纯化32
• 3.3 KLH-PepvlpX偶联蛋白的获得32
• 3.4 微孔板黏附试验定量检测重组蛋白和合成短肽黏附细胞能力32-34
• 4 结果与分析34-36
• 4.1 7种不含Ⅲ区重复片段的重组蛋白表达纯化34-35
• 4.2 不含Ⅲ区重复片段的重组蛋白vlpX0黏附细胞35
• 4.3 KLH-PepvlpX偶联蛋白黏附细胞35-36
• 5 小结36-37
• 试验三 vlpⅢ区重复次数差异对黏附能力的影响37-45
• 1 引言37
• 2 试验材料37-38
• 2.1 细胞和菌株37
• 2.2 主要试剂37
• 2.3 主要仪器37-38
• 2.4 主要溶液及配制38
• 3 试验方法38-39
• 3.1 不同Ⅲ区重复片段的重组蛋白的构建38
• 3.2 重组蛋白vlpXn的表达和纯化38-39
• 3.3 Westem Blot鉴定重组蛋白反应原性39
• 3.4 STEC和PK-15细胞膜蛋白制备39
• 3.5 微孔板黏附试验定量检测重组蛋白黏附细胞能力39
• 3.6 微孔板黏附试验结果数据处理39
• 4 试验结果39-44
• 4.1 重组质粒pET-32a(+)/vlpXn的PCR鉴定39-40
• 4.2 重组蛋白vlpXn的表达纯化和Western Blot鉴定40-43
• 4.3 重组蛋白vlpXn黏附细胞结果43-44
• 5 小结44-45
• 讨论45-47
• 1 支原体的黏附因子45
• 2 支原体的表面可变蛋白45
• 3 vlp黏附功能区鉴定及Ⅲ区重复次数的影响45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• Abstract52-54
• 致谢54

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 刘轶秋;丁家波;李蓓蓓;徐磊;张瑞婷;;支原体检验用培养基质控菌株的生长曲线与世代时间测定[J];中国兽药杂志;2012年12期

2 宁金鹰 ,黄u& ,吴健 ,孟麟 ,寿成超;猪鼻支原体蛋白P37诱导人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子[J];科学通报;2003年04期

3 孙玉宁,靳更林,张建芝,吴健,寿成超;猪鼻支原体P37蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2004年10期

4 白方方;武昱孜;刘茂军;冯志新;熊祺琰;韦艳娜;马庆红;邵国青;;猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立[J];中国预防兽医学报;2013年10期

5 熊祺琰;刘占军;马庆红;冯志新;刘茂军;白方方;邵国青;;重组猪鼻支原体P37蛋白的原核表达及免疫原性分析[J];中国预防兽医学报;2013年10期

6 马华崇,马泓,张艳丽,季加孚,王怡,李吉友,徐光炜,寿成超;胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定[J];中国人兽共患病杂志;2003年02期

7 刘文斌;孟麟;姜北海;寿成超;;猪鼻支原体膜蛋白p37酶切修饰的质谱分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2006年04期

8 熊祺琰;纪燕;刘占军;马庆红;冯志新;刘茂军;白方方;邵国青;;猪鼻支原体vlp重复区融合蛋白的构建表达及反应原性分析[J];中国人兽共患病学报;2013年09期

9 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 白方方;武昱孜;靳蒙蒙;刘茂军;冯志新;熊祺琰;邵国青;;巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年

2 危艳武;张志慧;黄立平;刘建波;吴洪丽;刘丹;李胜斌;王一平;张辉;夏伟;刘长明;;猪鼻支原体的分离鉴定及其对巴马猪的致病性试验[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年

3 李原园;刘茂军;邵国青;张映;;猪肺炎支原体检测技术的研究及与猪鼻支原体的鉴别[A];泛环渤海地区九省市生物化学与分子生物学会——2011年学术交流会论文集[C];2011年

4 邵国青;刘茂军;孙佩元;冯志新;王海燕;甘源;刘冬霞;;应用RAPD技术鉴定猪肺炎支原体和猪鼻支原体[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 ;喘迪[N];中国畜牧水产报;2000年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 张必雄;猪鼻支原体表面可变蛋白家族介导黏附宿主细胞能力研究[D];山西农业大学;2016年

2 JOYCE WANJIRU MAINGI;不同猪鼻支原体菌株的检测分离和比较以及实验感染模型的初步研究[D];南京农业大学;2014年

3 杨玉萍;（一）猪鼻支原体免疫胶体金快速检测卡的研制 （二）抗念珠状链杆菌单克隆抗体的制备和鉴定[D];中国协和医科大学;2007年

4 刘星;（一）抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立 （二）念珠状链杆菌血清学抗原检测方法的建立[D];中国协和医科大学;2009年

5 高林;Baytril对BHK-21细胞大肠杆菌、猪鼻支原体污染清除研究[D];甘肃农业大学;2005年

，

本文编号：966919