猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析

发布时间：2017-10-04 04:23

  本文关键词：猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析

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【摘要】：猪腺病毒3型(Porcine adeno virus 3, PADV-3)是猪腺病毒中最常见的一种血清型,主要引起猪群腹泻。1964年Haig首次从英格兰腹泻仔猪直肠拭子中分离到该病毒,随后在澳大利亚、美国、加拿大、西班牙、中国等国家相继被报道。目前,由于对PADV-3研究较少,在该病毒结构和功能、诊断方法、流行病学、致病性等方面均有待深入系统研究。本研究根据GeenBank中登陆的PADV-3 E1B基因序列(登录号：AB026117),利用Primer 5.0软件设计两对特异性引物,预计扩增片段大小分别为247 bp和194 bp。经条件优化,成功建立了针对PADV-3 PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法,两种方法的特异性和重复性较好,且均具有较高灵敏度,分别最低可检3.7×10~5拷贝/μL和3.1×10~2拷贝/μL。应用本研究建立的常规PCR开展PADV-3感染情况调查,对从四川省部分地区收集的283份粪便样品进行检测。结果显示,PADV-3总阳性率为7.07%(20/283),非腹泻猪群PADV-3阳性率为3.31%,腹泻猪群中PADV-3阳性率为9.87%,显著高于非腹泻猪群。应用所建实时荧光定量PCR开展PADV-3感染组织特性研究,对8头PADV-3感染阳性仔猪相应组织器官进行采样检测。结果显示,肠粘膜、肠系膜淋巴结、肺、扁桃体中PADV-3含量分别为2.24×10~4～6.42×10~5拷贝/mg、9.49×10~3-7.36×10~4拷贝/mg、5.59×10~3～1.65×10~5拷贝/mg和9.93×10~3～1.89×10~5拷贝/mg,病毒含量显著高于其它组织器官。根据GenBank中PADV-3 Hexon基因序列(登录号：AC 000189)设计两对引物。以阳性病料DNA为模板,分段扩增克隆,经测序分析,得到Hexon全基因序列(登录号：KU761583)。利用生物信息学软件对所获PADV-3 Hexon全基因进行分析。结果显示,所获Hexon全基因为2799 bp,编码932个氨基酸,理论分子质量为10~5653.8 u,理论等电点为5.23；该蛋白不稳定指数为42.92,属不稳定蛋白；且同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性。该蛋白最大疏水指数和最小疏水指数分别为2.289和-3.011,表现一定疏水性；氨基酸中无信号肽切割位点,推测该蛋白缺乏信号肽。Hexon蛋白含有25个丝氨酸、18个苏氨酸、21个络氨酸激酶磷酸化位点和35个抗原位点。将PADV-3克隆株(SCMS01株)与参考株的Hexon基因核昔酸序列进行同源性分析。结果显示,核苷酸同源性为87.8%-10~0%,表明PADV-3在各国之间流行不稳定。对SCMSOl株和参考株Hexon基因构建系统进化树。结果显示,SCMSOl株与德国株(PGOU244)在一个小分支上,两者亲缘性较高。
【关键词】：猪腺病毒3型 PCR Hexon基因 生物信息学分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 常用缩略词表8-13
• 文献综述13-21
• 1 病原学13-18
• 1.1 腺病毒的分类13-14
• 1.2 PADV-3基因组结构及特点14-15
• 1.3 PADV-3 Hexon和E区基因的结构功能15-16
• 1.4 PADV-3生物学特性16
• 1.5 PADV-3病原流行16-17
• 1.6 疫苗载体应用17-18
• 2 检测方法研究应用18-20
• 2.1 免疫电子显微镜18-19
• 2.2 酶联免疫吸附试验19
• 2.3 聚合酶链式反应19-20
• 3 前景展望20
• 4 研究的目的与意义20-21
• 第一章 猪腺病毒3型PCR检测方法的建立21-42
• 1 试验材料21-23
• 1.1 阳性病料21
• 1.2 临床样品的收集21-22
• 1.3 主要试剂22
• 1.4 主要仪器22
• 1.5 溶液配制22-23
• 2 试验方法23-30
• 2.1 PADV-3 PCR检测方法的建立23-28
• 2.1.1 引物合成与设计23
• 2.1.2 病毒DNA提取23-24
• 2.1.3 目的片段PCR扩增24
• 2.1.4 PCR产物的回收及纯化24-25
• 2.1.5 感受态细胞的制备25-26
• 2.1.6 连接转化26
• 2.1.7 质粒的提取与鉴定26-27
• 2.1.8 反应条件的优化27
• 2.1.9 特异性试验27
• 2.1.10 敏感性试验27
• 2.1.11 重复性试验27
• 2.1.12 PADV-3感染情况调查27-28
• 2.2 PADV-3实时荧光定量PCR检测方法的建立28-30
• 2.2.1 荧光定量PCR引物的设计28
• 2.2.2 病毒核酸的提取28
• 2.2.3 阳性标准品的制备28-29
• 2.2.4 反应条件的优化29
• 2.2.5 标准曲线的建立29
• 2.2.6 特异性试验29
• 2.2.7 实时荧光定量PCR和常规PCR敏感度29
• 2.2.8 重复性及再现性评估29-30
• 2.2.9 PADV-3感染组织特性研究30
• 3 结果30-39
• 3.1 PADV-3 PCR检测方法建立结果30-34
• 3.1.1 退火温度和引物浓度优化结果30-31
• 3.1.2 目的片段克隆与序列分析31
• 3.1.3 PCR的特异性试验结果31-32
• 3.1.4 PCR敏感性试验结果32
• 3.1.5 PCR重复性试验结果32-33
• 3.1.6 PADV-3感染情况调查33-34
• 3.2 PADV-3实时荧光定量PCR建立结果34-39
• 3.2.1 优化实时荧光定量PCR检测条件34
• 3.2.2 实时荧光定量PCR标准曲线的绘制34-35
• 3.2.3 熔解曲线和特异性分析35-36
• 3.2.4 PADV-3实时荧光定量PCR敏感性36-37
• 3.2.5 重复性及再现性评估37-38
• 3.2.6 PADV-3感染组织特性研究38-39
• 4 讨论39-41
• 4.1 PCR的检测方法39-40
• 4.2 实时荧光定量PCR的检测方法40-41
• 5 小结41-42
• 第二章 HEXON基因克隆分析42-52
• 1 试验材料42
• 1.1 生物信息学软件42
• 2 试验方法42-44
• 2.1 引物的设计与合成42
• 2.2 PADV-3 Hexon全基因克隆与测序42-43
• 2.3 Hexon蛋白基本理化性质分析43
• 2.4 Hexon基因密码子的偏嗜性分析43
• 2.5 抗原表位预测分析43
• 2.6 Hexon蛋白疏水性分析43
• 2.7 Hexon蛋白信号肽分析43
• 2.8 Hexon蛋白磷酸化位点分析43
• 2.9 遗传变异分析43-44
• 3 结果44-49
• 3.1 Hexon基因克隆与鉴定44-45
• 3.2 Hexon蛋白基本理化性质分析45
• 3.3 Hexon基因密码子的偏嗜性分析45
• 3.4 抗原表位预测分析45-46
• 3.5 Hexon蛋白疏水性分析46-47
• 3.6 Hexon蛋白信号肽分析47-48
• 3.7 Hexon蛋白磷酸化位点分析48
• 3.8 遗传变异分析48-49
• 4 讨论49-51
• 5 小结51-52
• 全文结论52-53
• 参考文献53-57
• 致谢57-58
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文58

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本文编号：968605