猪Rac1基因表达规律及真核表达载体的构建

发布时间：2017-10-04 12:23

  本文关键词：猪Rac1基因表达规律及真核表达载体的构建

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【摘要】：肌肉中肌纤维的数量在出生时期就已经固定,出生后数量不再发生变化。肌肉的发育不仅仅在于肌细胞的增殖,更与肌细胞的融合相关Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)是Rho GTP酶家族里Rac亚家族中的一员,可调控细胞极性、吞噬作用、细胞迁移、囊泡的转运以及调节肌动蛋白骨架的形成等。该基因与成肌细胞的融合密切相关,在肌纤维增粗和肌肉产量增多的过程中发挥重要作用。采用qRT-PCR和Western blot技术检测Racl基因在出生1日龄的马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胰脏、舌、小肠、下丘脑、胃、背最长肌等组织的mRNA和蛋白表达谱,以及Racl基因在马身猪和大白猪从1日龄到180日龄背最长肌中的表达,了解Racl基因的表达规律;成功构建了pAcGFP-Rac1真核表达载体,为研究Racl的功能奠定基础。主要结果如下：(1)Racl基因mRNA在出生1日龄马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胰脏、舌、小肠、胃和背最长肌组织中均有表达,其中,Racl基因mRNA在肺组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01),下丘脑中表达量较高,显著高于其他组织的表达情况(P0.05),肝脏组织中Racl的表达量最低。Racl蛋白在出生1日龄的马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾、脊髓、小脑、下丘脑、胃、背最长肌、腰大肌、股二头肌以及背部脂肪中表达,其中脊髓、下丘脑和背脂中表达量最高,与其他组织差异极显著(P0.01),脾脏、肺和肾脏表达量较高,小脑、胃部表达量较低且胃部表达量最低。(2)Racl基因mRNA在大白猪和马身猪背最长肌中的发育性表达模式中发现,大白猪1日龄、120日龄和180日龄时表达量最高,与其他日龄相比差异极显著(P0.01)。其他日龄表达量均维持在较低水平,且60日龄时表达量最低。马身猪60日龄时表达量最高,与其他日龄相比差异极显著(P0.01),90日龄时表达量显著下降,随后Racl基因的表达量呈下降趋势且维持在较低的表达水平,150日龄时表达量最低。同一发育阶段两品种间进行比较,mRNA水平上,除了30日龄外,其他几个日龄的表达量差异极显著(P0.01),但没有明显规律；蛋白水平上,大白猪在1日龄表达量最高,120日龄表达量最低,从30日龄至120日龄表达量成呈下降趋势,后又呈上升趋势;马身猪各日龄表达量均处于较高的水平,其中60日龄表达量最高,显著高于其他几个日龄(P0.01),90日龄时表达量最低。两猪种间比较发现,马身猪Racl蛋白每个阶段的表达量都高于大白猪,其中1日龄和60日龄的表达量差异极显著(P0.01)。(3)Racl基因克隆片段与pAcGFP-N1载体连接,通过PCR反应、单酶切和双酶切鉴定以及测序结果表明,pAcGFP-Rac1真核表达载体构建成功。
【关键词】：猪 Rac1基因 表达谱 发育性表达 pAcGFP-N1构建
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要7-9
• 前言9-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1 动物肌肉发育的研究10
• 1.1 动物肌肉发育的基本过程10
• 2 成肌细胞融合过程10-12
• 2.1 迁移10-11
• 2.2 识别和粘附11
• 2.3 粘附位点或者融合位点肌动蛋白的调控11-12
• 2.4 融合位点的囊泡的转运12
• 3 Rac1基因的研究进展12-17
• 3.1 Rac1基因简介12-13
• 3.2 Rac1基因和蛋白13
• 3.3 Rac1的作用机制13-14
• 3.4 Rac1的生物学功能14-17
• 4 展望17-18
• 第二章 马身猪不同组织Rac1基因mRNA和蛋白质表达谱18-32
• 1 材料与方法18-26
• 1.1 试验样品18
• 1.2 主要仪器18-19
• 1.3 主要试剂及配方19-21
• 1.4 试验方法21-26
• 2 结果与分析26-30
• 2.1 RNA的检测26
• 2.2 标准曲线的建立26-27
• 2.3 扩增动力学曲线27-28
• 2.4 扩增熔解曲线28
• 2.5 马身猪Rac1基因表达谱28-29
• 2.6 马身猪Rac1蛋白表达谱29-30
• 3 讨论30-32
• 第三章 马身猪和大白猪背最长肌中Rac1基因mRNA和蛋白的发育性表达32-37
• 1 材料与方法32
• 1.1 试验动物及材料32
• 1.2 试验仪器及试剂32
• 1.3 试验方法同第二章32
• 2 结果与分析同第二章32-35
• 2.1 大白猪和马身猪背最长肌Rac1 mRNA的发育性表达32-34
• 2.2 大白猪和马身猪背最长肌Rac1蛋白的发育性表达34-35
• 3 讨论35-37
• 第四章 Rac1基因融合蛋白真核表达载体pAcGFP-Rac1的构建37-56
• 1 材料与方法37-46
• 1.1 动物材料和质粒载体37-38
• 1.2 试验方法38-39
• 1.3 Rac1基因PCR扩增39-40
• 1.4 PCR产物的纯化与克隆40-41
• 1.5 Rac1基因克隆产物鉴定41-43
• 1.6 Rac1基因真核表达载体的构建43-46
• 2 pAcGFP-Rac1真核表达载体的鉴定46-47
• 2.1 pAcGFP-Rac1真核表达载体的PCR鉴定46
• 2.2 pAcGFP-N1-Rac1双酶切鉴定46-47
• 3 结果47-51
• 3.1 小鼠肌肉总RNA纯度及完整性鉴定47-48
• 3.2 小鼠肌肉组织Rac1基因PCR扩增结果48
• 3.3 Rac1基因的克隆测序48-51
• 4 pAcGFP-Rac1真核表达载体的构建51-55
• 4.1 带酶切位点的Rac1序列扩增51-52
• 4.2 Rac1基因片段和pAcGFP-N1载体双酶切52
• 4.3 pAcGFP-Rac1真核表达载体的验证52-54
• 4.4 pAcGFP-Rac1载体测序结果54-55
• 5 讨论55-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-61
• Abstract61-63
• 致谢63

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本文编号：970662