牛干扰素诱导蛋白10的原核表达及其单克隆抗体的研制

发布时间：2017-10-05 18:43

  本文关键词：牛干扰素诱导蛋白10的原核表达及其单克隆抗体的研制

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【摘要】：干扰素诱导蛋白10 (interferon-inducible protein-10, IP-10)是抗原提呈细胞经细胞因子刺激后分泌的趋化因子,属于CXC趋化因子家族。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同种异体移植排斥反应、肿瘤、慢性炎症等疾病中可选择性地募集T淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞到损伤部位,发挥重要的宿主免疫防护作用。最近的研究显示IP-10表达水平的改变与感染性疾病,包括炎症性疾病、免疫功能异常与肿瘤的发展等相关。IP-10也开始在牛结核等感染性疾病的诊断中作为重要的生物标志物,其效果也常与γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay, IGRA)相比较。有研究表明联合检测IFN-γ和IP-10能提高牛结核诊断的敏感性。本研究克隆表达了牛IP-10基因并制备了牛IP-10单克隆抗体,为牛结核的预防与诊断研究提供了重要的生物材料。1.牛IP-10基因的克隆及原核表达用ConA刺激健康奶牛外周血淋巴细胞,并提取细胞总RNA,以RT-PCR方法反转录为cDNA,再以cDNA为模板成功扩增到所需目的基因。将目的基因分别与表达载体pGEX-6p-1和pET-30a(+)相连接构建重组质粒,并进行鉴定。鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3),分别构建了BL21 (DE3)-pGEX-6p-1-BoIP-10和BL21(DE3)-pET-30a-BoIP-10。经IPTG诱导表达后的SDS-PAGE分析,出现预期的目的条带,条带大小分别为36 kDa和16 kDa左右。通过GST和His免疫亲和层析法进行蛋白的纯化,Western blot结果显示纯化蛋白具有良好的免疫反应性,说明2种标签的重组蛋白rGST-BoIP-10和rHis-BoIP-10均获得成功表达。2.牛IP-10单克隆抗体的制备与鉴定将纯化重组蛋白rHis-BoIP-10免疫6周龄BALB/c小鼠,经3次免疫后,运用淋巴细胞杂交瘤技术融合细胞,以纯化重组蛋白rGST-BoIP-10为检测原,运用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经过2次亚克隆后,共获得8株能稳定分泌特异性BoIP-10单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8、3A12。亚型鉴定结果显示2A5和3E12单抗为IgM亚型,3E11和2D5为IgG2a亚型,2H8的为IgG3亚型,1C6、3B12、3A12为IgG1亚型。间接ELISA测定效价结果显示3E11、2A5、3B12、 3E12、2H8五株单抗上清效价均不超过6400,其余3株1C6、2D5、3A12上清效价比较高,在1.0×104以上；制备上述单抗腹水,间接ELISA测定其效价,除了2A5的腹水效价比较低,其余7株单抗的腹水效价均在1.0×106以上。间接ELISA还显示3E11、2A5、 2D5、2H8四株单抗与大肠杆菌表达的商品化牛IP-10有较好的反应性,2A5、2D5、2H8等3株单抗与毕赤酵母表达的商品化牛IP-10有较好的反应性。Western blot结果显示所获得的8株单抗均与融合蛋白rHis-BoIP-10和rGST-BoIP-10发生反应。应用流式细胞术胞内染色技术分析单抗与天然IP-10蛋白的反应性,结果显示3E11,2D5和3A12与天然BoIP-10有较好的反应性。阻断ELISA结果也表明2D5与天然BoIP-10有较好的反应性。这些结果表明2D5单抗与天然牛IP-10反应性良好,具有较好的应用潜能。
【关键词】：牛干扰素诱导蛋白10 原核表达 ELISA 单克隆抗体
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 符号说明7-9
• 文献综述 IP-10的生物学特性及其在感染性疾病中的诊断价值9-21
• 1 IP-10生物学特性9-11
• 2 IP-10与疾病的关系11-13
• 3 IP-10对于感染性疾病的诊断价值13-15
• 参考文献15-21
• 第一章 牛IP-10基因的克隆及原核表达21-33
• 1. 材料与试剂21-22
• 2 方法22-27
• 3 结果27-31
• 4 讨论31
• 参考文献31-33
• 第二章 牛IP-10单克隆抗体的制备与鉴定33-48
• 1 材料与试剂33-34
• 2 方法34-40
• 3 结果40-46
• 4 讨论46-47
• 参考文献47-48
• 致谢48-49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：978192