下调TRIM28对牛早期胚胎印记甲基化维持的影响研究

发布时间：2017-10-06 00:28

  本文关键词：下调TRIM28对牛早期胚胎印记甲基化维持的影响研究

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【摘要】：基因组印记源于双亲基因组差异表观修饰,通过这种差异表观修饰机制,使父源或母源等位基因出现特异的单等位基因表达。在哺乳动物发育过程中,有两个重要的全基因组表观遗传重编程时期,分别是生殖细胞发育时期和受精后到早期胚胎发育时期。在此期间基因组印记甲基化经历一个去除、重建和维持的复杂过程。这个过程中的任何环节被干扰都将导致印记紊乱,造成胚胎发生、胎盘形成及出生后发育异常。因此,在早期胚胎全基因组重编程过程中,对印记的识别和维持十分重要。母源效应蛋白TRIM28在此过程中起重要的调控作用。本实验以牛为研究对象,通过亚硫酸盐测序、RNAi和荧光定量PCR等分子生物学和胚胎工程技术,分析精子、成熟卵母细胞(MⅡ)、植入前不同发育阶段IVF胚胎(2细胞、4细胞、8细胞、囊胚)及不同发育阶段TRIM28下调IVF胚胎相应的印记基因DMRs甲基化状态,探讨TRIM28在植入前胚胎印记基因甲基化维持中的作用,主要得出以下结果:1.运用免疫组化法和RT-PCR法对成熟卵母细胞(MⅡ)及颗粒细胞进行TRIM28的检测,证明卵母细胞及颗粒细胞中均有TRIM28的表达,其主要分布在卵母细胞细胞核及卵泡颗粒细胞核内。2.由上海吉玛公司化学合成3条针对TRIM28的siRNA(分别为1、6和7),以及1对无义siRNA(+),通过细胞转染的方法对si RNA干扰效果进行筛选,结果表明使用1、6、7三种siRNA的混合物(si M)对TRIM28进行下调干扰的效果最好,下调结果达到84.47%,表明RNAi技术是基因功能研究的有效途径。3.RNAi干扰对卵母细胞成熟及胚胎发育卵裂状况的影响:正常的卵母细胞成熟时间为18-22 h,成熟率为80.38±3.92%,TRIM28下调的卵母细胞的成熟时间为23-24 h,成熟率为75.44±2.30%,二者成熟率差异不显著。正常IVF胚胎开始卵裂时间为受精后16-22h,卵裂率为63.84±2.22%,TRIM28下调的IVF胚胎开始卵裂时间为受精后28-32 h,卵裂率为49.28±2.73%,二者差异显著。4.TRIM28下调对胚胎不同发育阶段印记基因DMRs甲基化程度的影响:正常IVF胚胎不同发育阶段(2细胞、4细胞、8细胞、囊胚)父系印记基因H19的DMRs甲基化程度分别为74.0%、68.40%、68.30%和84.20%,母系印记基因Mest的DMRs甲基化程度分别为88.1%、81.90%、78.50%和75.60%,Peg10的DMRs甲基化程度分别为88.5%、76.20%、85.00%和82.10%。卵母细胞TRIM28下调的IVF胚胎不同发育阶段(2细胞、4细胞、8细胞)父系印记基因H19的DMRs甲基化程度分别为1.9%、22.50%和39.70%,母系印记基因Mest的DMRs甲基化程度分别为89.6%、29.50%和54.50%,Peg10的DMRs甲基化程度分别为81.0%、67.10%和70.80%。综上,TRIM28在成熟卵母细胞(MⅡ)及颗粒细胞中均有表达,TRIM28下调对卵母细胞成熟影响较小,但对胚胎发育有显著影响;母源TRIM28下调对父系印记基因H19的DMRs甲基化程度的影响最为显著,2细胞H19 DMR甲基化几乎完全丢失,4细胞、8细胞阶段虽有一定程度上升,但仍显著低于IVF胚胎。但下调TRIM28对母系印记基因Mest和Peg10的DMRs甲基化程度的影响不显著。
【关键词】：印记基因 TRIM28 牛植入前胚胎 RNAi
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-15
• 1.1 印记基因10-12
• 1.2 转录共抑制因子TRIM2812-13
• 1.3 印记基因H19、Mest及Peg10的结构与功能13-15
• 第二篇 研究内容15-44
• 第一章 卵母细胞及颗粒细胞中TRIM28的检测15-23
• 1.1 材料15-16
• 1.2 研究方法16-19
• 1.3 结果与分析19-21
• 1.4 讨论21-22
• 1.5 小结22-23
• 第二章 下调TRIM28 siRNA的筛选23-31
• 2.1 材料23
• 2.2 研究方法23-28
• 2.3 结果与分析28-30
• 2.4 讨论30
• 2.5 小结30-31
• 第三章 TRIM28下调对胚胎发育及基因组印记的影响31-44
• 3.1 材料31
• 3.2 研究方法31-35
• 3.3 结果与分析35-40
• 3.4 讨论40-42
• 3.5 小结42-44
• 结论44-45
• 参考文献45-51
• 作者简介51-52
• 致谢52

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本文编号：979702