表达Flt3L的重组狂犬病病毒的构建及其免疫原性的研究

发布时间：2017-10-07 00:27

  本文关键词：表达Flt3L的重组狂犬病病毒的构建及其免疫原性的研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的以中枢神经系统感染为特征的人畜共患传染病,人和动物一旦发病死亡率几乎达100%(WHO 2009)。全世界每年因狂犬病死亡的人数超过55000人,我国是狂犬病高发国家之一。目前狂犬病尚无特效的治疗方法或药物,疫苗的预防接种是该病防控的重要手段。本研究通过反向遗传操作技术在狂犬病病毒疫苗株LBNSE基因组中插入鼠源FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)基因,构建了重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L。ELISA检测结果表明重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可在感染的BSR细胞表达Flt3L且具有剂量依赖性。LBNSE-Flt3L在体外生长曲线与亲本毒株几乎一致,表明外源基因Flt3L的表达对病毒的复制与扩散没有影响。脑部攻毒实验发现小鼠并无发病症状,其体重呈先下降后上升的趋势,较亲本毒株LBNSE对小鼠致病性减弱,但差异不显著。为进一步研究LBNSE-Flt3L的免疫原性,将重组狂犬病病毒免疫小鼠,与亲本病毒LBNSE进行比较,并将实验室之前构建的LBNSE-GM-CSF(Wen et al 2011)作为阳性对照。在免疫后第1-10周每周采血检测其体内的中和抗体水平,发现LBNSE-Flt3L和LBNSE-GM-CSF诱导的抗体水平在第四周均达到最高值,与亲本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L与LBNSE-GM-CSF相似,均能更快地诱导机体产生更高滴度的抗体。另外,在重组狂犬病病毒免疫后的第二周,对免疫小鼠进行了攻毒实验,脑内注射50LD50的CVS-24病毒,结果发现LBNSE-Flt3L的免疫保护率可达到80%,而LBNSE的免疫保护率则为45%。为进一步研究细胞因子Flt3L增强狂犬病病毒免疫原性的作用机制,我们分离了小鼠骨髓源树突状细胞(DC),并感染LBNSE-Flt3L,利用流式细胞仪检测了重组病毒LBNSE-Flt3L对树突状细胞(DC)的激活作用;同时,还将LBNSE-Flt3L感染6周龄小鼠,同样利用流式细胞术对其感染后DC的激活以及对生发中心(Germinal Center,GC)的B细胞的的促进情况进行分析。结果发现无论是体外还是体内实验,与Mock组和亲本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L均可以显著激活DC,与LBNSE-GM-CSF效果相当,并能促进更多GC B细胞的生成。总之,表达Flt3L的重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可以通过激活DC和促进GC B细胞的生成来增强免疫原性,提高抗病毒中和抗体的水平,从而提高了免疫保护率。本研究将为新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】：狂犬病 疫苗 Flt3L 中和抗体 树突状细胞
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 缩略语表（Abbreviation）9-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 狂犬病概述11
• 1.2 狂犬病病原学11-12
• 1.3 狂犬病流行病学12-13
• 1.3.1 传染源12
• 1.3.2 传播途径12-13
• 1.3.3 易感动物13
• 1.3.4 流行情况13
• 1.4 狂犬病临床诊断学13-14
• 1.4.1 临床症状13-14
• 1.4.2 诊断14
• 1.5 狂犬病防控现状14-15
• 1.5.1 国外防控现状14-15
• 1.5.2 国内防控现状15
• 1.6 狂犬病病毒致病机制15-16
• 1.6.1 狂犬病病毒受体15
• 1.6.2 狂犬病病毒结构蛋白对其致病性的影响15-16
• 1.7 狂犬病疫苗研究进展16-18
• 1.7.1 常规疫苗16-17
• 1.7.2 新型疫苗17-18
• 1.8 Flt3L研究进展18-21
• 1.8.1 Flt3L的结构与特性18
• 1.8.2 Flt3L的生物学活性18-21
• 第二章 研究目的及意义21-22
• 第三章 材料与方法22-36
• 3.1 材料22-24
• 3.1.1 细胞、病毒、细菌及载体22
• 3.1.2 主要药品及试剂22-23
• 3.1.3 主要相关试剂配制23
• 3.1.4 主要仪器与设备23-24
• 3.1.5 实验动物24
• 3.2 方法24-36
• 3.2.1 人源与鼠源Flt3L同源性的比较24
• 3.2.2 鼠源Flt3L基因的获取24-26
• 3.2.3 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的构建26-29
• 3.2.4 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的拯救29
• 3.2.5 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鉴定29-30
• 3.2.6 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的扩增30
• 3.2.7 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的滴定30
• 3.2.8 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生长曲线30
• 3.2.9 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性实验30-31
• 3.2.10 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保护率实验31-32
• 3.2.11 小鼠树突状细胞（DC）的体外分离与培养32-33
• 3.2.12 流式细胞术33-36
• 第四章 结果与分析36-50
• 4.1 人源与鼠源Flt3L同源性的比较36-37
• 4.2 鼠源Flt3L基因的获取37-38
• 4.3 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的构建38-39
• 4.4 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鉴定39-40
• 4.4.1 免疫荧光检测39
• 4.4.2 Flt3L的表达检测39-40
• 4.5 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生长曲线40-41
• 4.6 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性实验41
• 4.7 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保护率实验41-43
• 4.7.1 重组病毒免疫小鼠后中和抗体的测定41-42
• 4.7.2 重组病毒免疫小鼠后保护率实验42-43
• 4.8 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L对DC的体外激活43-45
• 4.9 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L对DC的体内激活45-48
• 4.10 重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L对GC B的影响48-50
• 第五章 讨论50-53
• 第六章 结论53-54
• 参考文献54-61
• 致谢61

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本文编号：985913