成年男性T淋巴细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面穿孔素及CD28表达的研究

发布时间：2018-02-21 01:04

  本文关键词： 妊娠丢失 过继转输 淋巴细胞 Exosomes 母胎免疫耐受 穿孔素 CD28　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：习惯性流产是指连续发生3次或3次以上的流产。其中60%左右为不明原因习惯性流产(URSA)，主要与免疫因素有关。生殖免疫研究认为，URSA是由于孕期母体对胚胎父系抗原耐受性不足或缺乏所致。因此，调节母体针对胚胎父系抗原的免疫应答，有效诱导母胎免疫耐受,是治疗URSA的关键。 目前，国内外多采用患者丈夫或无关个体的T淋巴细胞对URSA母体进行免疫治疗，取得了明显疗效，但仍存在制备不规范、个体差异大、疗效不稳定等缺陷，限制了临床推广应用。近年来研究发现，T细胞在生长增殖过程中分泌释放的一种称为Exosomes（Exo）的膜性非细胞微囊结构，可携带T细胞的核心功能分子，其独具优势的强稳定性、可规范性及高效安全性极具研究价值和广阔应用前景。本研究采用URSA实验动物模型，分析成年男性T淋巴细胞来源Exo调节母胎界面穿孔素以及CD28分子的表达，，探讨其诱导母胎免疫耐受的相关免疫学机制。 方法： 1.成年男性T淋巴细胞来源Exo的制备及初步鉴定：取成年健康男性静脉血提取淋巴细胞，经植物凝集素(PHA)体外诱导转化增殖后采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exo；扫描、透射电镜观察形态结构，紫外分光光度法测定其蛋白含量。 2.雄性小鼠无关个体脾细胞及其Exo的制备：断颈处死BALB/c雄鼠，无菌条件下解剖获取脾脏，经研磨、过滤，去除红细胞后制备脾细胞悬液，经刀豆蛋白A(ConA)体外诱导转化增殖后采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exo。 3.URSA动物模型建立及实验分组：将雌雄小鼠按2:1合笼交配；CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照组(Control)，CBA/J(♀)×DBA/2(♂)为URSA动物模型。再将URSA孕鼠随机分为4组：①妊娠丢失组(URSA组，于孕第4天着床期时尾静脉注射生理盐水)②细胞治疗组(CellularTherapy组，于孕第4天时尾静脉注射无关雄性个体脾细胞)③鼠源Exo治疗组（Exo Therapy-Ⅰ组，于孕第4天尾静脉注射小鼠雄性个体脾T淋巴细胞来源Exo）④人源Exo治疗组(Exo Therapy-Ⅱ组，于孕第4天时尾静脉注射成年男性T淋巴细胞来源Exo)。 4.胚胎发育情况的观察：于妊娠第14天时分别将各组CBA/J孕鼠处死，测量并计算胎盘体积，计数各组吸收胚胎个数和存活胚胎个数，计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。 5.孕鼠母胎界面穿孔素及CD28分子的表达分析：各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，解剖孕鼠取出胎盘组织，制备石蜡包埋切片。经免疫组化染色后进行图像分析，穿孔素及CD28分子表达强度以灰度值(GS)表示，GS值大小与阳性表达强度呈负相关关系；以矩形走形计数200个淋巴细胞，分别计算各组阳性细胞表达百分率。 6.统计学处理：各组数据均通过SPSS13.0版本软件行正态性检验、方差齐性检验，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况；采用F检验对孕鼠胎盘穿孔素及CD28分子的表达进行单因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法对多个样本均数间进行两两比较。显著性检验水准α=0.05。 结果： 1Exo的初步鉴定 扫描及透射电镜下观察发现，T细胞来源Exo呈椭圆形或圆形杯口状，直径约30nm～100nm，双层脂质膜完整，内为低电子密度物质。紫外分光光度法检测鼠源Exo、人源Exo蛋白含量分别为0.413±0.067,0.407±0.082（P0.05）。 2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响 Control组孕鼠胚胎吸收率为5.65%，URSA组为21.15%，细胞治疗组、鼠源Exo治疗组、人源Exo治疗组分别为8.01%、3.41%、2.05%。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的胚胎吸收率均显著下降(均P0.01)，其中，细胞治疗组及鼠源Exo治疗组可降至Control组水平（均P0.05），而人源Exo治疗组降低至低于Control组水平(P0.05)。 Control组孕鼠妊娠丢失率为26%， URSA组为66%，细胞治疗组、鼠源Exo治疗组、人源Exo治疗组分别为24%、18%、14%。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的妊娠丢失率均显著下降(均P0.01)；其中，细胞治疗组及鼠源Exo治疗组可降至Control组水平（均P0.05），而人源Exo治疗组降低至低于Control组水平(P0.05)。 3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎界面穿孔素表达的影响 Control组孕鼠胎盘组织中穿孔素阳性细胞表达率为18.7%±2.0%，URSA组显著上升为29.9%±2.6%(P0.0005)；细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后阳性细胞表达率分别回降至17.7%±1.2%、13.0%±1.9%、11.1%±2.1%(均P0.0005)；其中，两种非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P0.05)，鼠源、人源Exo治疗组之间未见显著差异(P0.05)。 Control组孕鼠胎盘组织中穿孔素表达强度的GS值为130.9±6.1，URSA组显著上升为93.9±9.9(P0.0005)；细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后表达强度分别回降至134.0±5.9、154.2±8.2、154.7±9.3(均P0.0005)；其中,非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P0.05)，鼠源、人源Exo治疗组之间未见显著差异(P0.05)。 4不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎界面CD28分子表达的影响 Control组孕鼠胎盘组织中CD28分子阳性细胞表达率52.7%±5.3%，URSA组显著上升为65.8%±8.2%(P0.05)；细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后阳性细胞表达率分别回降至50.2%±4.7%、34.7%±5.6%、25.8%±4.4%(分别P0.05、P0.001、P0.001)；其中非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P0.05)，人源Exo治疗组比鼠源Exo治疗效果更显著（P0.05)。 Control组孕鼠胎盘组织中CD28分子表达强度为117.9±2.7，URSA组显著上升为96.7±6.8(P0.001)；细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后表达强度分别回降至117.3±2.2、130.9±4.7、143.9±7.1(分别P0.05、P0.001、P0.001)；其中非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P0.05)，人源Exo治疗组比鼠源Exo治疗效果更显著（P0.0005)。 结论： 1无关雄性个体外周淋巴细胞和T细胞来源Exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受形成，有利于妊娠顺利进行。且Exosomes可发挥比外周淋巴细胞更强大的效应。 2无关雄性个体外周淋巴细胞和T细胞来源Exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母胎界面穿孔素及CD28分子表达变化，降低T、NK细胞对胚胎抗原及胎盘组织细胞的毒性作用，从而有效诱导母胎免疫耐受。 3人源Exosomes可比鼠源Exosomes发挥更强大的诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的效应。
[Abstract]:Objective: habitual abortion refers to the continuous occurrence of abortion 3 times or more than 3 times. About 60% of them for unexplained habitual abortion (URSA), mainly related to immunological factors. The immune response that is due to URSA caused by maternal paternal on embryo antigen tolerance insufficient. Therefore, regulation of the immune response according to the maternal embryo paternal antigen, effectively induce immune tolerance, is the key to the treatment of URSA.
At present, many domestic and foreign patients with husband or unrelated individual T lymphocyte immunotherapy on URSA matrix, has made the obvious effect, but there are still some preparation is not standardized, individual differences, the effect of unstable defects such as limited clinical application. Recent studies showed that T cells secrete in the process of proliferation a method called Exosomes (Exo) of the non cell membrane microcapsule structure, core functional molecules can carry T cells, the unique advantages of strong stability, can be very efficient and normative research of safety value and broad application prospects. This research adopts the URSA experimental animal model, analysis of adult male T lymphocyte derived Exo regulation maternal fetal interface of perforin and CD28 expression, to investigate the induction of immunotolerance related immunological mechanisms.
Method锛

本文编号：1520557