IK基因的失活性突变及其蛋白缺失在子宫内膜癌中的作用研究

发布时间：2018-03-29 12:22

本文选题：IK细胞因子　切入点：子宫内膜癌　出处：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：子宫内膜癌是常见的妇科三大恶性肿瘤之一,在最近十年发病率及致死率明显上升,已成为最常见的妇科生殖系统恶性肿瘤。根据病理学类型子宫内膜癌又可以被分为I型子宫内膜癌(雌激素依赖型)及II型子宫内膜癌(非雌激素依赖型)。其中I型子宫内膜癌占子宫内膜癌的大多数(70-80%),大部分预后较好,病理类型主要为子宫内膜样腺癌。尽管I型子宫内膜癌总的预后大体跟国际妇产科协会(FIGO)分期及肿瘤级别相关,然而,对于具有相同或者类似组织学类型的I型子宫内膜癌患者来说,仍有一些特定的患者对治疗的反应及预后不近相似。所以单纯依靠组织学及病理学类型来评估子宫内膜癌的临床预后,特别是I型子宫内膜癌,显得不是很充足,需要进一步的分型确定。另外对于子宫内膜癌的治疗,除了标准的手术术式,铂类药物为代表的化疗也是最常用的治疗方法,但是铂类化疗药只在敏感的肿瘤细胞中才可以造成DNA损伤及细胞凋亡,没有完整DNA修复途径的肿瘤细胞对DNA损伤造成的凋亡更敏感,更容易死亡,因此,弱化DNA修复的能力似乎可以解决化疗耐药,从而使肿瘤病人得到更好的治疗效果。我们课题组的前期研究显示,部分晚期(IV组)子宫内膜样子宫内膜癌患者的预后比早期的(II组)患者要好,而且只有IV组患者有IK基因的突变。所以IK基因的突变有可能和子宫内膜癌患者的临床预后有关。目前对于IK细胞因子在子宫内膜癌中的研究尚无报道,课题组对美国癌症基因组数据库(TCGA)中子宫内膜癌数据进一步的分析指出IK基因突变的类型主要是移码突变,此突变类型可以引起IK蛋白表达的缺失,是一种失活性突变。并且IK基因的突变与IK基因的低表达具有相关性,与子宫内膜癌患者的预后呈正相关。所以本研究利用人来源子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞通过体外实验探讨IK的下调对子宫内膜癌可能造成的影响及其作用机制。第一部分IK细胞因子的缺失对子宫内膜癌细胞生长的影响目的:探讨IK蛋白的下调对子宫内膜癌细胞系生长的影响方法:采用si RNA转染的方法下调IK蛋白,并在转染24小时,48小时及72小时后采用Western blot的方法检测下调的结果;采用细胞活力实验(CCK-8)、克隆形成实验、细胞凋亡实验(Anexin V-FITC/PI双染色法)、细胞死亡实验(Trypan blue染色法)及细胞周期实验(PI染色法)分别检测IK的下调对子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞的活力、增殖、凋亡、死亡及细胞周期的影响。并利用western blot的方法检测细胞自噬相关蛋白,利用吖啶橙染色法确定IK下调时导致的细胞阳性染色率。并且利用凋亡抑制剂(Q-VD-OPH)及自噬抑制剂(3MA),采用Trypan blue染色法分别检测当子宫内膜癌细胞内IK的蛋白表达下降导致细胞死亡时,其是否对细胞死亡造成影响。结果:Si RNA转染的方法可以下调IK的蛋白表达,以转染48小时及72小时后更为明显。并且IK的下调可以抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞的活力及增殖。在IK si RNA转染48小时和72小时后,还可导致细胞周期G2/M期的阻滞,细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达水平下降,IK的下调还可活化半胱天冬酶(caspase)3、7、8及9,并降低抗凋亡蛋白BCL-2的蛋白表达,增加凋亡指示蛋白cleaved PARP的蛋白表达,导致细胞凋亡及死亡。IK的下调还可以导致细胞自噬相关蛋白LC3BI向LC3BII转化,P62蛋白表达下降,吖啶橙染色阳性率提高。应用细胞凋亡抑制剂(Q-VD-OPH)后可以减少细胞死亡率,而应用细胞自噬抑制剂(3MA)后,细胞死亡率反而增加。结论:IK的下调可以抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞的正常生长,抑制细胞有丝分裂的正常进行,促进细胞凋亡性的死亡。第二部分IK细胞因子的缺失对子宫内膜癌细胞DNA损伤修复通路的影响及其作用机制的研究目的:探讨IK蛋白的下调对子宫内膜癌细胞系DNA损伤修复通路的影响及其可能的作用机制。方法:Si RNA转染72小时后,采用DNA损伤检测试剂盒,γ-H2AX免疫荧光染色的方法及western blot的方法检测IK的下调对子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞DNA损伤的影响;利用同源重组修复试剂盒及非同源末端连接修复检测法检测IK的下调对DNA修复通路的影响;在DNA损伤的情况下,利用蛋白质谱分析及免疫沉淀法检测可能与IK结合的相关DNA修复蛋白,并用免疫沉淀法进一步分析IK的下调可能对蛋白结合能力造成的影响;利用细胞活力实验、细胞凋亡实验及细胞死亡实验检测IK的下调是否使子宫内膜癌细胞对顺铂作用更敏感。结果:Si RNA转染72小时后,IK的下调可以导致子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞的DNA损伤,γ-H2AX的细胞染色阳性率增多,western blot结果也证实γ-H2AX的蛋白表达增多。IK的下调还导致同源重组及及非同源末端连接DNA修复能力下降。DNA损伤的情况下,蛋白质谱分析结果显示IK可以与非同源末端连接关键蛋白Ku80结合,进一步的免疫沉淀结果也证实了此结果。并且免疫沉淀结果证实IK的下调可以抑制Ku80与Ku70的异二聚体化的能力;IK的下调使子宫内膜癌细胞对顺铂的作用更加敏感,下调IK并且同时应用顺铂可以显著降低细胞的活力,促进细胞凋亡及死亡。结论:IK的下调可以造成子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE细胞的DNA损伤并通过抑制Ku80与Ku70的异二聚体化进而抑制其DNA修复通路;IK的下调使子宫内膜癌细胞对顺铂的作用更加敏感。综上所述,IK的突变主要是移码突变,一种失活性突变,其突变与m RNA及蛋白表达具有相关性,并且与子宫内膜癌患者的临床预后呈正相关。体外实验证实IK的下调可以抑制DNA修复通路,促进DNA损伤进而抑制子宫内膜癌细胞的正常生长,其作用机制可能与IK的下调抑制Ku80及Ku70异二聚体化的能力有关,并且IK的下调使子宫内膜癌细胞对顺铂的作用更加敏感,将来可作为子宫内膜癌治疗的一个新靶点。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

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