第二代高通量测序分析VVC及RVVC患者阴道菌群结构

发布时间：2018-04-30 07:58

  本文选题：外阴阴道假丝酵母菌病 + 菌群结构　； 参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景女性生殖道是人体四大生态系统中较复杂的一个生态系统,由阴道解剖结构、内分泌调节以及微生态菌群共同组成。健康女性生殖道内存在较多正常的微生物群落,与宿主、环境之间构成相互制约、相互协调、动态平衡的关系,是宿主抵御致病菌或条件致病菌的重要微生物屏障,与人体健康和疾病的关系密切。但由于受到环境变化、药物刺激、宿主的激素水平和免疫状态等因素的影响,女性生殖道内的微生态菌群平衡状态被打破而失衡,从而导致疾病的发生。因此,全面了解阴道微生态的菌群组成以及动态变化,有助于我们了解生殖道感染疾病的发生、发展过程,进一步指导临床采取及时的干预措施,使用适当的药物治疗,避免滥用药物治疗。由于阴道菌群主要为厌氧茵,培养营养条件要求苛刻,使用传统培养和分离鉴定的方法很难全面认识阴道菌群构成,限制了对阴道微生物群落菌群多样性与疾病关系的进一步研究。近年来随着分子生物学技术的迅速发展,非培养依赖性技术的发明,人们对阴道微生物菌群的认识取得了突破性进展。微生物的分类鉴定从表型特征鉴定深化为基因特征鉴定。16S rRNA基因聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增是目前最常用的检测阴道微生物的非培养法。我们通过Illumina Solexa高通量测序平台测序、结合带标签的基于荧光测序平台的双末端测序(Barcoded Paired-End Illumina Sequencing, BIPES),可快速、全面了解阴道微生物群落结构信息,外阴阴道假丝酵母菌病((vulvovaginal candidiasis, WC)是由假丝酵母菌引起的一种常见的外阴阴道炎性疾病,约有5%发展为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis, RWC)。因其引起瘙痒等症状影响妇女的工作和生活,又因其容易反复发作经久不愈成为临床研究的一个难点。VVC、RWC的发病与多种因素有关,发病机制仍未明确,目前研究提示与阴道内自身微生物菌群的结构及微环境变化有关。但假丝酵母菌感染后阴道菌群是否发生改变,如何改变,目前仍无定论。本研究通过Illumina高通量测序技术以及BIPES的序列研究方法,比较了解健康育龄女性、VVC和RWC患者的微生物群落结构,追踪健康育龄女性以及VVC患者阴道菌群随月经周期的动态变化,为进一步探讨VVC和RWC的病因、治疗以及预防提供理论依据。研究目的1、通过Illumina高通量测序技术以及BIPES的序列研究方法,了解健康育龄女性、WC和RWC患者阴道微生物菌群的结构,分析阴道菌群的多样性改变,了解VVC和RWC患者在发作时期阴道菌群与健康育龄女性的差异。2、追踪健康育龄女性、VVC患者在月经周期变化中的阴道菌群结构信息,探讨其菌群结构动态变化的模式及与月经周期的关系。方法1,实验对象：实验一：选取2013年4月～2013年10月就诊于佛山市顺德区第一人民医院妇科门诊的患者12例,平均年龄(28.83±6.10)岁。VVC组5例,纳入标准：①症状：外阴瘙痒、灼痛,伴有尿痛以及性交痛等症状：阴道分泌物增多。②体征：外阴潮红、水肿,可见抓痕,甚至皲裂,小阴唇内侧及阴道粘膜附着白色膜状物,阴道内较多的白色分泌物,呈凝乳状或豆腐渣样。③实验室检查：阴道分泌物镜检找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝,或培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。RVVC组5例,纳入标准：①1年中发作WC_4次。②实验室检查：阴道分泌物镜检找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝,或培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。健康组(Healthy)2例,纳入标准：①无临床症状。②阴道清洁度为Ⅰ～Ⅱ级。③实验室检查：阴道分泌物镜检未找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝。实验二：2013年6月～2013年9月就诊于佛山市顺德区第一人民医院妇科门诊体检的健康女性2名,平均年龄(27.00±3.00)岁,纳入健康组(Healthy).纳入标准：①～③同实验一；④月经正常。WC组3例,平均年龄(29.00±4.16)岁。纳入标准：①～③同实验一；④月经正常。以上各组均为我国汉族人,排除标准：研究对象1个月内无全身应用抗生素及阴道局部用药史,3天内无性生活史以及阴道灌洗;排除妊娠期、哺乳期；排除全身系统性疾病如：糖尿病、激素治疗性疾病(如急慢性肾炎)等；排除滴虫性、细菌性阴道病或需氧型阴道炎等。另外实验二还需满足以下条件：目前均只有一个性伴侣,采用避孕套避孕或自然避孕法,无口服避孕药物。2.取样：实验一、实验二各组研究对象知情同意后,用无菌阴道棉拭子于阴道壁中上段取阴道分泌物,标本送检。实验二研究对象的取样时间是月经周期中的第2、4、7、14、16、21、27天。3.所有标本采用DNA提取试剂盒(深圳易瑞)提取样本总DNA,具体操作步骤参照说明书。4.16srRNA V4区基因片段的扩增及Illumina测序：以样本总DNA为模版,采用引物514F和805R,扩增其中的16S rRNA V4区基因。PCR产物以相等的终浓度混合均匀,通过Illumina HiSeq2000平台进行双末端100bp测序(华大基因,深圳)。5.测得序列经过BIPES流程进行初步处理。使用TSC进行聚类,提取出每个操作分类单元(Operational taxonomy unit, OTU)的代表序列后,利用GAST进行物种的分类,其中属于乳酸菌属的OTU利用：megablast进一步分到种级别,后续分析包括聚类分析,Alpha多样性和Beta多样性分析。基于Unifrac距离,采用QIIME进行阴道菌群主分分析。采用linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在线工具分析患者特殊的阴道菌群。6.统计学处理：应用SPSS 13.0软件进行统计分析,计数资料采用率或构成比表示。计量资料组内或组间比较采用方差分析,对多样性指数、各菌属的相对丰度进行Wilcoxon秩和检验,P0.05为差异具有统计学意义。结果实验一：1.测序数据采用BIPES流程进行分析,采用UCHIME去除嵌合体序列,本实验测序样品数12个,最终共获得852992条序列,平均每个样品71083条。2.根据QIIME分析流程进行beta多样性分析,展示三组菌群之间的相似度。VVC组菌群Beta多样性最高,分布广泛。RVVC组分布紧凑,菌群结构相似度高。健康组Beta多样性介乎RVVC与VVC之间。3.通过PD whole tree比较三组样品的Alpha多样性,分析显示VVC患者的阴道菌群Alpha多样性最高,提示其菌群Alpha多样性较RVVC及健康组明显增加(T-test,P0.05)。4.在菌属的水平上,健康组主要以卷曲乳杆菌为优势菌,达95%以上。WC组菌群构成呈现多样化改变,乳杆菌属丰富度显著降低,由最多的68%下降至0.2%,加德纳菌、普氏菌属、双歧杆菌丰富度明显增加。RVVC组菌群构成以惰性乳杆菌为优势菌,约占85%。5.通过LEfSe统计三组菌属差异发现,VVC组的放线菌门、双歧杆菌属、双歧杆菌门以及金黄杆菌的丰度较RVVC和健康组明显增高。而嗜血菌属在健康组则明显增高。实验二：1.测序数据采用BIPES流程进行分析,采用UCHIME去除嵌合体序列,本实验测序样品数12个,最终共获得105796条干净序列,平均每个样品92610条。2.分别用Chaol、Observed species、PD whole tree、Shannon四个指标展示5个研究对象在月经周期中阴道菌群的alpha多样性变化。其中健康组的H2和VVC组的V2的alpha多样性指数最低,说明阴道菌属构成相对单一。3.通过计算欧式距离来展示5个研究对象在月经周期中阴道菌群的波动。在月经第2天的菌群结构与月经第7天明显拉开距离,提示月经第7天阴道菌群明显有变化,阴道优势菌群迅速生长,菌群的多样性由复杂化趋向于单一化。4.在菌属水平上,随着月经周期变化,健康组主要以卷曲乳杆菌为优势菌,VVC组阴道菌群结构相对复杂,阴道优势菌群可为惰性乳杆菌(2/3),也可为加德纳菌(1/3)。整个月经周期阴道菌群处于相互交替的动态变化中。阴道菌群多样性增高,则月经周期中菌群波动较明显。5.选取OUT数量最多的前15位菌属,通过折线图可见5个研究对象阴道菌群在月经周期中的均有变化。阴道优势菌群的变化显示有2种模式：一种模式是相互交替变化：自月经期后阴道优势菌迅速生长至排卵期前达高峰,在排卵期(月经第14天)开始出现下降,至月经期达最低点,其他阴道菌群则相应增多；另外一种模式是保持绝对优势的模式。自月经期后,阴道优势菌大量生长,一直保持较高的丰富度,至月经前期才出现逐渐下降。结论1.健康育龄女性和RWC患者阴道菌群结构简单,VVC患者菌群多样性增高。2.健康女性阴道优势菌群为卷曲乳杆菌,RVVC患者则以惰性乳杆菌为优势菌群。VVC患者阴道菌群的乳杆菌属比例降低,加德纳菌、普氏菌属、双歧杆菌等菌属丰富度增加。3.阴道菌群随月经周期的变化而出现波动,以月经前后变化最大。阴道优势菌群变化呈现相互交替变化或保持绝对优势的模式。4.在月经周期中健康育龄妇女仍以卷曲乳杆菌为优势菌群,而VVC组中以惰性乳杆菌或其他菌种为优势菌群,菌群多样性变化增高。5.通过16S rRNA基因以及Illumina测序发现健康育龄妇女和WC患者在月经周期中在阴道内一直存在卷曲乳杆菌与惰性乳杆菌,并与多种微生物共存。
[Abstract]:In recent years , with the rapid development of molecular biology and the development of non - culture - dependent techniques , it is difficult to fully understand the composition of vaginal flora and to prevent the use of drug therapy . In this study , the structure of vaginal flora in female , VVC and RWC patients with healthy reproductive age was studied by Illumina high - throughput sequencing technique and sequence research method of BIPES . 2 cases of healthy women ( 27.00 卤 3.00 ) years of age ( 27.00 卤 3.00 ) were included in the health group ( Healthy ) .
The average age ( 29.00 卤 4.16 ) years of normal menstruation in WC group was normal . The standard was 鈶，

本文编号：1823736