细胞骨架蛋白MICAL-L2和ACTN4在上皮性卵巢癌中的表达及其功能研究

发布时间：2018-09-14 10:12

【摘要】：目的：通过对上皮性卵巢癌组织和细胞的体内外实验研究，探讨细胞骨架蛋白MICAL-L2及其相互作用蛋白α-辅肌蛋白4（ACTN4）在卵巢癌发生发展和侵袭转移中的作用及可能机制。 方法：（1）用免疫组化法检测人上皮性卵巢癌组织芯片中MICAL-L2蛋白的表达，探讨MICAL-L2与人卵巢癌临床病理特征之间的关系。（2）利用慢病毒转染技术构建稳定干扰MICAL-L2的人卵巢癌细胞株，采用CCK8方法、划痕实验、空穿实验、胶穿实验等方法检测干扰MICAL-L2后对细胞增殖，迁移及侵袭功能的影响。（3）利用细胞免疫荧光技术检测干扰MICAL-L2后细胞形态变化及EMT相关分子标志物的变化。（4）利用western blotting方法检测EMT相关分子标志物及下游通路中相关分子在干扰MICAL-L2组和对照组中的变化情况。（5）利用RT-PCR方法检测EMT过程中相关转录因子的变化。（6）利用荧光素酶报告基因检测Wnt通路中TOP/FOP的活性变化情况。（7）利用RT-PCR方法及siRNA干扰方法初步验证MICAL-L2与ACTN4的相互作用关系。（8）利用TCGA数据库分析ACTN4与卵巢癌预后之间的关系。（9）利用MTT和流式细胞术的方法分析ACTN4与卵巢癌耐药的关系及可能机制。 结果：（1）MICAL-L2在上皮性卵巢癌中的高表达率（68.60%）明显高于正常对照组（16.67%），差异有显著性（P0.0001）。MICAL-L2在卵巢癌III-IV期中的高表达率（81.40%）显著高于I-II期（55.81%）（P=0.011）；在组织学分级为G2、G3中的高表达率显著高于G1期（P=0.009）。（2）稳定干扰MICAL-L2基因后，与对照组比较，细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱，差异有显著性（p值均＜0.01）。(3)细胞免疫荧光检测F-actin、上皮分子标志物E-cadherin、间质分子标志物vimentin发现，干扰稳定MICAL-L2后细胞形态发生重要变化，由梭形变为圆形，细胞与细胞间连接更加紧密，，上皮分子标志物E-cadherin明显增多，间质分子标志物vimentin表达明显下降。（4）western blotting结果显示：上皮分子标志物E-cadherin表达升高，间质分子标志物vimentin表达明显下降，胞核中β-catenin表达明显降低，胞浆中无变化，p-β-catenin无变化，Wnt/β-catenin通路下游Cyclin-D1表达降低。(5) RT-PCR方法检测EMT转录因子SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1和ZEB2在干扰MICAL-L2组和对照组变化，结果显示干扰MICAL-L2后SNAIL和SLUG无变化，TWIST、ZEB1和ZEB2在mRNA水平表达明显降低且有统计学意义（P0.05）。（6）TOP/FOP荧光素酶报告基因检测Wnt通路中转录活性的变化，结果显示干扰MICAL-L2后TOP活性较对照组明显降低，FOP活性无明显变化。（7）RT-PCR方法及siRNA干扰方法分析MICAL-L2与ACTN4的关系，结果发现在高表达MICAL-L2的细胞株中ACTN4表达也相应较高，瞬时干扰MICAL-L2后ACTN4表达也明显降低（8）TCGA数据库分析ACTN4与卵巢癌患者预后明显相关，ACTN4基因改变的患者预后较差，且有统计学意义（P0.01）。(9)转染ACTN4-siRNA的卵巢癌细胞对化疗药紫杉醇敏感性增加（P＜0.05)，凋亡率增加（P＜0.05)。 结论： 1、卵巢癌组织中MICAL-L2高表达与卵巢癌临床分期和组织学分级有关。 2、MCIAL-L2可促进卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭。 3、MICAL-L2能促进卵巢癌细胞EMT的发生。 4、激活经典的Wnt/β-catenin通路以及促进Rac1的活化可能是MICAL-L2引起卵巢癌细胞EMT的发生的机制之一 5、ACTN4与卵巢癌不良预后关系密切，其可能通过抑制卵巢癌细胞的凋亡参与对紫杉醇的化疗抵抗。 6、抑制MCIAL-L2和ACTN4将为卵巢癌的临床治疗提供一个新的靶点。
[Abstract]:Objective: To investigate the role of cytoskeleton protein MICAL-L2 and its interacting protein alpha-comyosin 4 (ACTN4) in the development, invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer (EOC) in vitro and in vivo.
Methods: (1) The expression of MICAL-L2 protein in human epithelial ovarian cancer tissue microarray was detected by immunohistochemistry, and the relationship between MICAL-L2 and clinicopathological characteristics of human ovarian cancer was studied. (2) The human ovarian cancer cell line stably interfering with MICAL-L2 was constructed by lentivirus transfection technique. CCK8 method, scratch test, empty puncture test and adhesive puncture test were used. Methods The effects of interfering with MICAL-L2 on cell proliferation, migration and invasion were examined. (3) Cell morphology and EMT-related molecular markers were detected by immunofluorescence assay. (4) EMT-related molecular markers and related molecules in downstream pathway were detected by Western blotting. (6) The activity of TOP/FOP in Wnt pathway was detected by luciferase reporter gene. (7) The interaction between MICAL-L2 and ACTN4 was preliminarily verified by RT-PCR and siRNA interference. (8) The interaction between MICAL-L2 and ACTN4 was analyzed by TCGA database. The relationship between TN4 and the prognosis of ovarian cancer. (9) The relationship between ACTN4 and drug resistance in ovarian cancer was analyzed by MTT and flow cytometry.
Results: (1) The high expression rate of MICAL-L2 in epithelial ovarian cancer (68.60%) was significantly higher than that in normal control group (16.67%). The high expression rate of MICAL-L2 in ovarian cancer stage III-IV (81.40%) was significantly higher than that in stage I-II (55.81%) (P = 0.011); the high expression rate in histological grade G2 and G3 was significantly higher than that in stage G1 (P = 0.009). After stably interfering with MICAL-L2 gene, the proliferation, migration and invasiveness of the cells were significantly decreased compared with the control group (p < 0.01). (3) F-actin, E-cadherin and vimentin were detected by immunofluorescence, and the morphology of the cells was significantly changed after interfering with the stabilization of MICAL-L2. The results of Western blotting showed that the expression of E-cadherin increased, the expression of vimentin decreased, the expression of vimentin decreased and the expression of E-cadherin decreased. The expression of Cyclin-D1 in the downstream of Wnt/beta-catenin pathway was decreased. (5) The expression of SNAIL, SLUG, TWIST, ZEB1 and ZEB2 in the interfering MICAL-L2 group and control group was detected by RT-PCR. The results showed that SNAIL and SLUG did not change after interfering with MICAL-L2, and the expression of TWIST, ZEB1 and ZEB2 decreased significantly at mRNA level. Low and statistically significant (P 0.05). (6) TOP / FOP luciferase reporter gene detection of Wnt pathway transcriptional activity, the results showed that after interfering with MICAL-L2, TOP activity was significantly lower than the control group, FOP activity was not significantly changed. (7) RT-PCR and siRNA interference analysis of the relationship between MICAL-L2 and ACTN4, the results showed that the high expression of MICAL-L2 fine. The expression of ACTN4 was also higher in the cell lines, and the expression of ACTN4 was significantly lower after transient interference with MICAL-L2. (8) TCGA database analysis showed that ACTN4 was significantly correlated with the prognosis of ovarian cancer patients, and the prognosis of patients with ACTN4 gene change was poor, and there was statistical significance (P 0.01). (9) The sensitivity of ovarian cancer cells transfected with ACTN4-siRNA to paclitaxel increased (P < 0.0). 5) apoptosis rate increased (P < 0.05).
Conclusion:
1, the high expression of MICAL-L2 in ovarian cancer is related to the clinical stage and histological grading of ovarian cancer.
2, MCIAL-L2 can promote the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cells.
3, MICAL-L2 can promote the occurrence of EMT in ovarian cancer cells.
4. Activating the classical Wnt/beta-catenin pathway and promoting the activation of Rac1 may be one of the mechanisms of EMT induced by MICAL-L2 in ovarian cancer cells.
5. ACTN4 is closely related to the poor prognosis of ovarian cancer. It may participate in the chemotherapeutic resistance to paclitaxel by inhibiting the apoptosis of ovarian cancer cells.
6, inhibition of MCIAL-L2 and ACTN4 will provide a new target for clinical treatment of ovarian cancer.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【共引文献】

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本文编号：2242409