胎盘特异性抗原8（PLAC8）在人类早期胚胎发育及囊胚体外植入过程中的表达

发布时间：2018-11-02 17:29

【摘要】：研究背景胎盘特异性抗原8 (placenta-specific 8, PLAC8),是近年来被发现的在小鼠胎盘富集的生物分子。PLAC8被报道参与斑马鱼的早期胚胎发育和小鼠的胎盘发育。国外多项研究结果表明,PLAC8可能是牛胚胎着床过程中的关键分子,可作为生物标志分子之一预测牛的妊娠结局。有关PLAC8的生殖生物学功能研究尚处于起步阶段,PLAC8在人类早期胚胎的表达、定位及胚胎早期植入过程中是否表达目前尚无人报道。研究目的在分子与细胞水平探究PLAC8在人类早期胚胎发育和体外植入过程中的表达,为进一步功能研究提供理论支持。研究方法利用人体外受精-胚胎移植过程中分级标准达不到移植和冷冻要求的废弃的患者自愿捐赠用于科学研究的卵母细胞和胚胎,通过预实验摸索确定采用少量细胞RNA提取试剂盒提取单个卵子、2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的RNA,总样本33个,包括3个卵母细胞,每一时期胚胎各6个(正常受精、异常受精各3个),进一步通过荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)进行定量分析,检测PLAC8 mRNA在不同时期的人类早期胚胎中的表达;同时通过胚胎免疫荧光染色技术,进行不同时期的人类早期胚胎PLAC8蛋白表达的检测,共检测53个人类卵母细胞／胚胎,包括12个卵母细胞,4个2-细胞期胚胎,4个4-细胞期胚胎,8个8-细胞期胚胎,7个桑椹胚和18个囊胚,明确PLAC8蛋白在着床前胚胎中的时空表达;建立稳定的人子宫内膜基质细胞-人胚胎共培养的体外植入模型,观察25枚解冻并经辅助孵化后完全孵出的人类囊胚的体外植入过程,通过免疫荧光染色技术检测共培养模型中发生植入的胚胎PLAC8蛋白是否表达及其表达模式。结果1、首次对PLAC8 mRNA在人类不同发育阶段的早期胚胎的表达进行了单胚胎定量分析。在卵母细胞、2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、异常受精桑椹胚中,未检测到PLAC8 mRNA的表达,正常受精桑椹胚PLAC8 mRNA的检出率为33%,囊胚检出率为100%。正常和异常受精囊胚PLAC8 mRNA相对表达量无统计学差异。在人类早期胚胎发育过程中,蛋白酶体亚基β6 (PSMB6)比肌动蛋白ACTB(β-actin)表达更稳定。2、首次对PLAC8蛋白在人类早期胚胎的表达进行了定位。PLAC8蛋白在所有人类卵母细胞和不同发育阶段的早期植入前胚胎均有表达(阳性率100%),主要分布在细胞质,荧光强度由细胞膜及膜下区域向细胞核周围逐渐减弱,细胞核内未见荧光信号。3、成功构建了人子宫内膜基质细胞-人类囊胚共培养体外植入模型。采用0.5mmol/l的8-Br-cAMP和1.0μmol/l的MPA联合诱导蜕膜化,总的蜕膜化时间96h。4、应用体外植入模型首次对PLAC8蛋白在人类早期胚胎体外植入过程中的表达进行了研究和定位。PLAC8蛋白在人类囊胚体外植入过程中发生植入并扩展的囊胚有明显表达,分布于细胞质和细胞核核仁区。结论1、PLAC8 mRNA随着人类胚胎发育至桑椹胚出现表达,囊胚100%表达。PSMB6是更好的内参基因的选择。PLAC8蛋白在人类卵母细胞和不同发育阶段的早期植入前胚胎均有表达,主要分布在细胞质。2、人子宫内膜基质细胞-人类囊胚共培养模型是体外研究人类胚胎植入过程的有力工具。3、PLAC8蛋白在人类囊胚体外植入过程中有表达且定位发生变化,与胚胎的植入状态相关。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.8

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