人子宫内膜间充质干细胞的分离、鉴定及生长因子对其向韧带成纤维细胞分化作用研究

发布时间：2020-03-18 17:29

【摘要】：目的:1.体外分离人子宫内膜间充质干细胞(human endometrial mesenchymal stem cell,hEMSCs),探讨其是否具有MSCs特性。2.研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与转化生长因子-β_1(Transforming growth factors-β_1,TGF-β_1)对体外培养hEMSCs向韧带成纤维细胞分化作用影响。方法:1.hEMSCs的体外分离、鉴定:采用酶消法结合反复贴壁法分离纯化获得的hEMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态。流式细胞仪检测细胞表面特异抗原阳性率。采用特定的诱导培养基体外诱导hEMSCs向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞的分化,并分别使油红0染色、茜素红染色及阿利新蓝染色法检测hEMSCs向成脂、成骨及成软骨细胞分化效果。MTS检测细胞增殖活性并绘制细胞的生长曲线。2.使用第四代hEMSCs,按照在培养基中分别添加bFGF、TGF-β_1以及bFGF+TGF-β_1联合处理为实验组,加入正常培养基为对照组。培养3天后倒置相差显微镜下观察各组细胞形态变化情况;培养12、24、36、48、60h MTS检测各组细胞增殖活性情况;培养3天后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞Ⅰ型胶原mRNA表达情况及免疫荧光检测各组细胞Ⅰ型胶原蛋白表达情况。3.应用graphpad prism 7软件包进行数据处理。所有数据结果均采用平均数±标准差(?±)表示。两组间差异比较采用t检验,以α=0.05作为检验水准,P0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.采用酶消法结合反复贴壁法可体外分离纯化hEMSCs。倒置显微镜下观察hEMSCs经多次传代后其细胞形态均一,呈成纤维样,呈旋涡状或平行排列生长。流式细胞仪检测第四代hEMSCs表面特异抗原表现出CD73、CD90、CD105阳性,分别为99.9%、97.3%、99.7%;CD34、CD45、CD11b、CD19及HLA-DR阴性,为1.7%。油红O染色显示:成脂诱导后,细胞浆内可见脂滴;茜素红染色显示:成骨诱导后细胞外存在多个矿化结节;阿利新蓝染色显示:成软骨诱导后,大量的糖胺聚糖被分泌到细胞基质中。细胞生长曲线显示细胞增殖能力强。以上结果证实获得的细胞符合间充质干细胞的特征。2.分别经bFGF、TGF-β_1及bFGF+TGF-β_1联合干预后:(1)培养3天后倒置相差显微镜下观察示细胞形态结果显示:与对照组比较,bFGF组、bFGF+TGF-β_1组细胞形态更加细长,呈“树突”状,更趋向于成纤维细胞特性,而TGF-β_1组细胞形态增宽,呈扩散趋势。(2)MTS检测培养12、24、36、48、60h各组细胞细胞增殖速率结果显示:bFGF组、TGF-β_1组、bFGF+TGF-β_1组细胞增殖速率较对照组均明显增快,差异具有统计学意义(P0.05);与bFGF组、TGF-β_1组相比较,bFGF+TGF-β_1组细胞增殖速率增快更加明显,差异具有统计学意义(P0.05);提示bFGF与TGF-β_1均可以促进细胞增殖,且两者联合后促进细胞增殖作用更加显著。(3)培养3天后实时荧光定量PCR结果显示:与对照组比较,bFGF组Ⅰ型胶原mRNA表达明显下调,TGF-β_1组及bFGF+TGF-β_1组Ⅰ型胶原mRNA表达均上调,差异均具有统计学意义(P0.05),但bFGF+TGF-β_1组Ⅰ型胶原mRNA表达上调趋势小,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)免疫荧光染色结果显示:I型胶原蛋白主要分布在细胞质内。与对照组比较,bFGF组Ⅰ型胶原蛋白表达明显降低,TGF-β_1组及bFGF+TGF-β_1组Ⅰ型胶原蛋白表达均有所增加,但bFGF+TGF-β_1组Ⅰ型胶原蛋白表达增加程度小。结论:1.hEMSCs具有MSCs特征,可作为韧带组织工程种子细胞来源。2.bFGF可促使hEMSCs细胞形态更趋向成纤维细胞特性。bFGF与TGF-β_1联合促进hEMSCs增殖的效果更加明显。bFGF、TGF-β_1对I型胶原合成具有一定的拮抗作用,bFGF具有抑制I型胶原合成的效应,而TGF-β_1则具有促进I型胶原合成的效应,bFGF与TGF-β_1联合使I型胶原的合成和降解的处于动态平衡的状态,总体增加了I型胶原的表达量,对hEMSCs向韧带成纤维细胞分化具有促进作用。
【图文】：

山西医科大学（博）硕士学位论文1 hEMSCs 的原代及传代培养采用酶消化法获取的 hEMSCs，在体外能快速贴壁生长，增殖速率快，倒置微镜观察到原代 hEMSCs 接种 4-5d 后大部分能贴壁，呈短梭形或纺锤形，见细胞达到 80%融合时将细胞进行消化、传代。经 1-2 次传代后，获得的 hEM度较高。传代培养的细胞，贴壁时间快，约 2-4h，形态较为均一，传代培养 3-4融合达 80-90%，细胞大多为细长、均一的成纤维样细胞，呈旋涡状或平行排，见图 1-B。2 结果

图 2 流式细胞仪检测第四代 hEMSCs 表面特异性抗原的表达情况A: PE-negative CD34+CD19+CD45+CD11b+HLA-DR； B: APC- CD73； C:FITC-PerCP-Cy5-5- CD105.2 细胞染色法观察 hEMSCs 向成脂、成骨及成软骨细胞分化.2.1 hEMSCs 成脂诱导结果诱导培养 3d 后观察，，细胞形态出现由长梭形逐渐缩短变圆或多边形浆内出现脂滴样物质，更换诱导培养基后也不会消失。随着诱导时间的物质逐渐变大，诱导 19d 后油红 O 染色显示：胞浆内脂滴被染成红色
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.5

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本文编号：2588962