携带miR-302a的人脐带间充质干细胞来源外泌体对子宫内膜癌的作用研究

发布时间：2020-03-19 05:37

【摘要】：目的探讨携带miR-302a的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)来源的外泌体对子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)的作用,研究结果将为miRNA的有效运输提供了新方法,为外泌体的研究和子宫内膜癌的治疗提供新思路和新方法。方法1.从临床来源的子宫内膜癌组织和与其匹配的癌旁组织样本中分析差异表达的microRNA(miRNA),通过qPCR验证获得影响子宫内膜癌发生发展的、有抑癌作用的miRNA(miR-302a)。2.原代hUCMSCs的分离提取与鉴定:收集新鲜无菌的脐带,采用组织贴壁法获取原代hUCMSCs,培养基为α-MEM(10%胎牛血清)。通过流式细胞仪检测hUCMSCs的表面标记物CD45、CD73、CD90和CD105的表达。成脂和成骨分化能力的检测。3.富含miR-302a的hUCMSCs来源的外泌体的提取与鉴定:构建慢病毒载体感染hUCMSCs过表达miR-302a,收集培养48h的hUCMSCs无血清培养上清,采用ExoQuick TC试剂盒从hUCMSCs培养上清中提取其分泌的外泌体。通过透射电镜观察外泌体的形态,运用Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)技术检测外泌体浓度粒径。Western blot检测外泌体的标志分子CD63、CD81和HSP70的表达。4.富含miR-302a的hUCMSCs来源的的外泌体对子宫内膜癌细胞(Ishikawa和ECC-1)增殖、迁移等生物学功能的影响,并进一步检测靶基因Cyclin D1以及AKT的表达。结果1.通过临床样本的分析,获得的差异表达miRNA中,miR-302a能够有效抑制子宫内膜癌细胞(Ishikawa和ECC-1)增殖、迁移等功能。2.采用组织贴壁法可以从脐带华通胶中提取hUCMSCs。hUCMSCs为贴壁细胞,呈长梭形,生长迅速。第三代hUCMSCs通过流式细胞仪检测高表达CD73、CD90和CD105,不表达CD45。hUCMSCs具有成脂和成骨分化的能力。3.通过ExoQuick TC试剂盒可从hUCMSCs培养上清中提取其分泌的外泌体。透射电镜下观察呈典型的杯口状,NTA检测外泌体的粒径范围介于40-200nm,Western blot结果显示外泌体的标记分子CD81和HSP70均阳性。4.hUCMSCs来源的富含miR-302a的外泌体能抑制子宫内膜癌细胞(Ishikawa和ECC-1)增殖、迁移,并通过抑制AKT和Cyclin D1的表达而实现对子宫内膜癌细胞的增殖和迁移的抑制。结论1.过表达miR-302a能够抑制子宫内膜癌的增殖和迁移2.miR-302a可由间充质干细胞分泌的外泌体递送至子宫内膜癌细胞并抑制其增殖和迁移3.miR-302a通过下调cyclinD1和AKT1抑制子宫内膜癌细胞的增殖和迁移。
【图文】：

AAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTCACTTTGGCCGCGGCTCGAGGGGGTTGGGGTGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGTCCTGCCCGCGCGTGTTCCGCATTCTGCAAGC2a 感染子宫内膜癌细胞的效率，转染慢病毒后，，miR-302a 在 ISK 和 ECC-1 细胞

R-302a 对 EC 细胞增殖的影响( P < 0.01, a 过表达抑制体外 EC 细胞的迁移毒表达载体使ISK和ECC-1细胞过表达miR-3能的影响。如图 3 所示，这两种细胞的迁移能
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

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本文编号：2589788