二甲双胍通过降低H3K27me3水平抑制卵巢癌的恶性进展

发布时间：2020-03-19 15:14

【摘要】：第一部分二甲双胍抑制卵巢癌的恶性进展目的:明确二甲双胍对卵巢癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响方法:1.在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、ES2中,建立正常葡萄糖浓度(5.5 m M)及高葡萄糖浓度(25 m M)细胞培养模型。2.给予卵巢癌细胞10 m M二甲双胍24 h,采用Ed U实验技术检测增殖的改变,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡的改变,划痕实验和Transwell迁移实验检测迁移的改变。3.给予卵巢癌细胞10 m M二甲双胍24 h,采用PCR技术检测MMP 11,Caspase 3,Caspase 7,Caspase 9,Bax,bcl-2 m RNA水平。结果:1.二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖。1)在正常糖条件下,与空白对照组相比,二甲双胍给药组SKOV3,A2780和ES2细胞的增殖率分别下降9.1%(PSKOV3=0.0023),33.37%(PA27800.0001)和34.7%(PES2=0.0010);2)在高糖条件下,与空白对照组相比,二甲双胍给药组SKOV3,A2780和ES2细胞的增殖率分别下降6.55%(PSKOV3=0.0043),38.72%(PA27800.0001)和33.96%(PES2=0.0004);3)与高糖组相比,二甲双胍对正常糖组卵巢癌细胞增殖能力的抑制更加明显(PSKOV3=0.0020,PA2780=0.0009,PES2=0.0467)。2.二级双胍促进卵巢癌细胞凋亡。1)在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后SKOV3,ES2细胞的凋亡率显著增加(PSKOV3=0.0152,PES2=0.0051)。2)与高糖组相比,给予二甲双胍后正常糖组的所有三种卵巢癌细胞系均表现出较高的细胞凋亡率(PSKOV3=0.0051,PA2780=0.0245,PES2=0.0062)。3.二甲双胍抑制卵巢癌细胞迁移。1)在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后卵巢癌细胞的划痕愈合能力明显降低(PSKOV3=0.0334,PA2780=0.0024,PES2=0.0004),且迁移至下室的细胞数目明显减少(PSKOV3=0.0044,PA2780=0.0001,PES2=0.0001)。2)在高糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后SKOV3、ES2细胞的划痕愈合能力降低(PSKOV3=0.0052,PES2=0.0120),且迁移至下室的细胞数目减少(PSKOV3=0.009,PES2=0.0006)。3)与高糖组相比,给予二甲双胍后正常糖组的所有三种卵巢癌细胞系均表现出较低的划痕愈合能力(PSKOV3=0.0207,PA2780=0.0056,PES2=0.0263),且迁移至下室的细胞数目明显减少(PSKOV3=0.0480,PA27800.0001,PES2=0.0002)。4.在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予2.5 m M二甲双胍后卵巢癌细胞SKOV3、ES2凋亡率并无明显改变(PSKOV3=0.5252,PES2=0.4476);而划痕愈合能力明显降低(PSKOV3=0.0193,PES2=0.0349)。5.在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后卵巢癌细胞SKOV3的MMP11 m RNA水平降低,Caspase 7、Caspase 9、Bax m RNA水平增加(PMMP11=0.0245,PCaspase 7=0.0486,PCaspase 9=0.0225,PBax=0.0366);Caspase 3 m RNA水平增加8倍以上,但P=0.6172,差异不具有统计学意义。结论:二甲双胍能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力、促进其凋亡能力。降低葡萄糖浓度能够增强二甲双胍的抗肿瘤效果。第二部分二甲双胍通过降低H3K27me3水平抑制卵巢癌的恶性进展目的:明确二甲双胍是否通过调节组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)影响卵巢癌的恶性进展。方法:1.给予SKOV3、A2780、ES2细胞不同浓度(0、2.5、5、10 m M)二甲双胍,采用western blot技术检测H3K27me3、多梳抑制复合体2(PRC2)的三个主要组成蛋白Zeste基因增强子的同源基因(EZH2)、Zeste抑制子12(SUZ12)、胚胎外胚层发育因子(EED)蛋白水平,采用PCR技术检测EZH2、SUZ12、EED m RNA水平。2.SKOV3、ES2细胞转染携带EZH2过表达慢病毒载体,筛选单克隆,建立EZH2稳转细胞株和空载体阴性对照。3.EZH2稳转细胞株和阴性对照细胞使用5 m M二甲双胍处理24 h,采用Ed U实验技术检测增殖能力,Annexin V-PE/7-AAD流式细胞术检测凋亡,划痕实验和Transwell迁移实验检测迁移能力。结果:1.二甲双胍降低卵巢癌细胞H3K27me3蛋白水平。1)在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后三种卵巢癌细胞株H3K27me3水平均明显下降,且这种降低随着二甲双胍浓度的增加更加明显;2)在高糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后SKOV3细胞H3K27me3水平轻微降低。2.二甲双胍降低卵巢癌细胞EZH2、EED、SUZ12水平。1)在正常糖条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后三种卵巢癌细胞株EZH2、SUZ12、EED m RNA及蛋白水平均明显降低,且这种降低随着二甲双胍浓度的增加更加明显,而高糖条件下,二甲双胍对卵巢癌细胞EZH2、SUZ12、EED m RNA及蛋白水平的抑制并不明显。2)在高糖条件下,给予二甲双胍后SKOV3细胞EED m RNA水平降低,但其蛋白水平并无明显改变;且在二甲双胍处理条件下SKOV3细胞SUZ12蛋白水平降低,但其m RNA水平并无明显改变,提示二甲双胍对卵巢癌细胞PRC2的影响可能存在转录后的调控。3.上调H3K27me3逆转二甲双胍对卵巢癌的抑制。1)与阴性对照细胞相比,EZH2稳转细胞株H3K27me3蛋白水平明显增加。2)与阴性对照细胞相比,EZH2稳转细胞株增殖率增加(PSKOV3=0.0243,PES2=0.0009),划痕愈合能力增强(PSKOV3=0.0063)、迁移至下室的细胞数目增加(PSKOV3=0.0360,PES2=0.0232)。3)在阴性对照细胞中,与空白对照组相比,给予二甲双胍后卵巢癌细胞增殖率降低(PSKOV3=0.0004,PES2=0.0009)、划痕愈合能力减弱(PSKOV3=0.0028),迁移至下室的细胞数目减少(PSKOV3=0.0109,PES2=0.0102),凋亡率增加(PSKOV3=0.0350,PES2=0.0286);4)在EZH2稳转细胞株中,与空白对照组相比,给予二甲双胍后卵巢癌细胞增殖率、凋亡率、划痕愈合能力及迁移至下室细胞数目均无明显改变(P0.05)。结论:二甲双胍抑制卵巢癌细胞PRC2功能,且二甲双胍通过降低H3K27me3水平抑制卵巢癌的恶性进展。第三部分二甲双胍通过AMPK途径抑制H3K27me3水平目的:明确二甲双胍是否通过AMPK途径降低H3K27me3。方法:1.给予卵巢癌细胞SKOV3、A2780、ES2不同浓度(0、2.5、5、10 m M)二甲双胍24 h,采用western blot技术检测AMPK、P-AMPK蛋白水平。2.给予SKOV3、ES2细胞另一种AMPK激活剂2-DG(25 m M)24 h,采用western blot技术检测AMPK、P-AMPK、H3K27me3、PRC2蛋白水平。3.用AMPK抑制剂Compound C(20μM)预处理SKOV3、ES2细胞2 h,再给予5 m M二甲双胍24 h,采用western blot技术检测AMPK、P-AMPK、H3K27me3、PRC2蛋白水平。结果:1.二甲双胍在卵巢癌细胞中激活AMPK。1)正常糖培养条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后SKOV3、A2780、ES2细胞P-AMPK/AMPK比例明显增加,且这种增加趋势随着二甲双胍浓度的增加更加明显;2)而高糖培养条件下,与空白对照组相比,给予二甲双胍后SKOV3、A2780、ES2细胞P-AMPK/AMPK比例仅有轻微增加。2.与对照组相比,给予2-DG后SKOV3、ES2细胞P-AMPK/AMPK比例增加,H3K27me3、EZH2、SUZ12、EED蛋白水平降低。3.与空白对照组相比,二甲双胍与Compoud C联合用药组P-AMPK/AMPK比例不再增加;且与二甲双胍单药组相比,二甲双胍与Compoud C联合用药组H3K27me3、EZH2、SUZ12、EED蛋白水平增加。结论:二甲双胍通过激活AMPK降低H3K27me3水平。
【图文】：

32图 1. EdU 增殖实验检测给予 10 mM 二甲双胍 24 h 后卵巢癌细胞 SKOV3、A2780、ES2 增殖能力。（A、C、E 图）为荧光显微镜放大 100×采集的图像。红色 EdU 染色显示的是增殖细胞，蓝色 Hoechst 染色显示的是总的细胞。Merge 是将两张图像滤色融合之后的图像。（B、D、F 图）为统计学分析图表。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.2、二甲双胍促进卵巢癌细胞凋亡。AnnexinV-FITC / PI 流式细胞术检测显示，在正常糖培养条件下，与空白对照组相比，给予 10 mM 二甲双胍 24 h 后，SKOV3 和 ES2 细胞的凋亡率显著增加

华中科技大学博士学位论文（PSKOV3=0.0152，PES2=0.0051），差异具有统计学意义。与 25 mM 葡萄糖浓度组相比，，在 5.5 mM 葡萄糖浓度培养条件下，给予二甲双胍的所有三种卵巢癌细胞系均表现出较高的细胞凋亡率（PSKOV3=0.0051，PA2780=0.0245，PES2=0.0062），差异具有统计学意义（图 2）。以上结果提示二甲双胍能够促进卵巢癌细胞凋亡，降低葡萄糖浓度增强二甲双胍对卵巢癌细胞凋亡的促进。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

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本文编号：2590393