LSD1通过调节mTOR信号通路抑制卵巢癌细胞自噬的机制研究

发布时间：2020-03-24 04:22

【摘要】：目的本文旨在探究LSD1在人卵巢癌细胞自噬中的作用,并揭示其参与自噬过程的具体调控机制,为探寻新的卵巢癌发病机制和潜在的分子靶向治疗方案提供数据支撑和理论基础。方法1.采用慢病毒转染的方法用卵巢癌HO8910细胞株构建稳定传代的诱导型敲减LSD1的细胞模型,Western blotting和qRT-PCR观察LSD1的敲减程度及其特异性底物H3K4me2水平的变化。2.Western blotting方法检测敲减LSD1表达和抑制LSD1酶活性对自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白表达的影响。3.qRT-PCR检测敲减和抑制LSD1对自噬相关基因LC3 mRNA表达水平的影响。4.免疫荧光技术(Immunofluorescence)观察敲低LSD1表达或抑制LSD1酶活性后内源性LC3的表达及聚集变化,进而探讨LSD1与细胞自噬发生的关系。5.GFP-LC3单荧光体系示踪技术将GFP-LC3质粒转染入LSD1敲低或抑制的HO8910细胞株内,观察GFP-LC3为代表的外源性自噬小体的聚集情况。6.无血清的DMEM(饥饿)和雷帕霉素(Rapamycin)诱导HO8910细胞自噬发生,利用Western blotting检测在自噬状态下LSD1的表达变化,进一步佐证LSD1在卵巢癌细胞自噬中的作用。7.Western blotting检测敲减LSD1表达对mTOR活性的影响,然后利用mTOR的激活剂MHY1485激活mTOR信号,进一步检测LSD1调控细胞自噬与mTOR信号通路的依赖关系,从而探讨LSD1影响卵巢癌细胞自噬的作用机制。结果1.本研究通过慢病毒介导在卵巢癌HO8910细胞株内稳定诱导敲低LSD1的方法效果显著,在Dox诱导下,LSD1的表达在转录(mRNA)和翻译(蛋白质)水平均显著降低,且降低程度与Dox呈时间剂量依赖性方式;相反,LSD1的特异性甲基化底物H3K4me2的表达水平显著增高,表明诱导型稳定敲低LSD1表达的HO8910细胞株成功建立,为后续实验提供了稳定高效的细胞模型。2.Western blotting结果显示敲低LSD1表达或抑制LSD1酶活性导致自噬标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白水平显著升高,且蛋白升高的趋势与Dox呈时间剂量依赖性方式,而并不影响另一自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达。另外,qRT-PCR结果显示,LSD1表达或酶活性受抑后,LC3 mRNA表达水平并无变化。3.Western blotting和免疫荧光结果显示LSD1的敲低或抑制显著诱导HO8910细胞自噬的发生。4.血清饥饿和雷帕霉素诱导自噬发生后,HO8910细胞内LSD1蛋白的表达被明显抑制;用Dox诱导LSD1下调后,导致饥饿和雷帕霉素诱导的自噬通量进一步累积,提示LSD1可能涉及饥饿和雷帕霉素诱导自噬的过程,且LSD1的表达受到饥饿或雷帕霉素这两种自噬刺激因素的负反馈调节。5.LSD1的下调或抑制可以引起mTOR信号通路失活,从而导致细胞自噬水平上调,用MHY1485激活mTOR信号后,LSD1下调所导致的自噬激活被阻断,表明LSD1下调诱导的细胞自噬是通过抑制mTOR信号通路实现的。结论1.LSD1在卵巢癌HO8910细胞中负向调控细胞自噬的发生;2.通过sh RNA技术敲低LSD1或药物性抑制LSD1酶活性能够诱导细胞自噬的发生,刺激自噬流的累积;3.干扰LSD1表达显著增强饥饿或雷帕霉素诱导的自噬,且LSD1的表达受自噬刺激因素的负反馈调节;4.LSD1调节卵巢癌细胞自噬的过程依赖于对mTOR信号通路的调控。
【图文】：

模式图,结构域,二甲基,模式图

1.2.1 LSD1 概述组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶 1（LSD1）是首个被证实的组蛋白去甲基化酶[20]，它是一种进化上比较保守的、FAD依赖的胺氧化酶家族的成员之一[21]，主要有三个晶体结构域组成：N端的SWIRM结构域、C端的AOL结构域和位于AOL-N端与C端中间的Tower 结构域 (图1.1A)。其中SWIRM结构域用于蛋白质间相互作用；AOL结构域主要调控LSD1与其底物结合，对于LSD1发挥其特异性去甲基化功能至关重要；Tower结构域可维持AOL的空间构型，若Tower结构域碱基缺失或突变可直接导致LSD1的活性丧失[22, 23]。LSD1的主要功能体现为：在FAD的催化下，能特异性催化和移除组蛋白H3第4位赖氨酸K4(H3K4) 的单甲基（me1）和二甲基（me2）修饰；在雄激素的诱导下，LSD1能特异性去除H3K9me1/2的甲基修饰，使其恢复未甲基状态，从而影响靶基因结构功能的改变导致其转录激活或失活[20, 24](图1.1B)。

模式图,模式图,自噬,有害物质

中研究的自噬的类型[36]，，见图1.2。图1.2 自噬小体的形成模式图[37]Fig 1.2 The formation of autophagosomes[37]1.3.2 自噬与肿瘤的关系由于自噬的主要生理功能是清除受损衰老的细胞器，防止有害物质的堆积，并为机体的平稳运行提供代谢所需底物和能量，因此细胞内保持一个正常低水平的自噬有利于细胞抵抗环境、病原体入侵等压力，延长细胞的寿命。肿瘤形成早期时，自噬有利于机体抵抗外源入侵的有害物质，清除肿瘤形成灶，抵抗和抑制肿瘤的发生[38]。众多报道发现，在人类的许多难治性疾病例如帕金森海默症、肿瘤等组织细胞中都伴随自噬水平受损低下或缺陷的现象[39]。随着肿瘤组织的形成壮大，自噬此时又有助于帮助肿瘤细胞度过高代谢导致的营养缺乏的危机、清除由于肿瘤组织的高破坏性导致的正常组织细胞凋亡坏死的碎片、协助肿瘤细胞躲过机体免疫监视，推进肿瘤的发展[33]。报道称
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】