免疫性卵巢早衰中Treg调控B细胞功能的初步研究

发布时间：2020-03-30 06:01

【摘要】：研究背景及目的卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF),也称原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI),是一种高度异质性疾病,影响着0.5-3.0%的育龄期女性。未经治疗的卵巢早衰患者发生骨质疏松,心血管疾病,认知能力下降和帕金森等疾病的风险成倍增加,严重损害女性生殖健康和生活质量~([1])。因此,卵巢早衰的防治受到越来越多学者的关注。所有形式的卵巢衰老(Premature ovarian senescence,POS)多经历了隐匿期,生化期和终末期。早期都是无症状的过程,发现时其卵巢功能完全丧失,且几乎无治疗方法~([2])。卵巢早衰的病因和发病机制尚不完全清楚,已知的病因包括:遗传,感染,环境,免疫,化疗,放疗和手术等。9%-40%的卵巢早衰患者合并有其他自身免疫性疾病,如原发性肾上腺皮质功能不全(Addison's病)或自身免疫性甲状腺疾病(Grave's或Hashimoto病),因此推动了对POF自身免疫病因的研究。近年来许多研究者提出自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease,AOD)可能是POF发病的免疫学机制~([3-5])。前期研究证实早期过继回输正常小鼠的Treg(Regulatory T cells)细胞可有效预防D3tx(thymectomizeon day3)小鼠自身免疫性卵巢疾病的发生,提示Treg细胞的异常/耗竭在自身免疫性卵巢疾病发生发展中具有关键的作用~([6,7])。研究同时观察到在回输前的D3tx小鼠卵巢组织中可见大量浸润的T细胞和B细胞,而回输后未见,推测Treg细胞的功能紊乱与体液免疫/B细胞的后续效应性变化密切相关~([8])。这样的调节作用是Treg细胞通过直接抑制和调节效应T细胞功能维持自身耐受性和免疫稳态?还是Treg细胞直接抑制和调节B细胞功能?为回答这一问题,本研究检测了自身免疫性卵巢疾病小鼠模型中Treg细胞和B细胞的时相性变化,初步探索Treg调节B细胞功能的作用机制,以期为卵巢早衰早期免疫学改变提供新线索,进而提出POF/POI治疗的新方法。研究方法通过摘除新生第3天BALB/c小鼠胸腺,建立AOD小鼠动物模型(D3tx组/实验组);定期采集外周血、卵巢、脾脏及盆腔淋巴结组织等,分别用于ELISA检测性激素及辅助T细胞相关炎症因子,HE染色观察卵巢组织形态学改变;流式细胞学检测脾脏与盆腔淋巴结中CD4~+T细胞、Treg细胞以及B细胞亚群(活化B细胞、浆细胞)的动态变化;Treg细胞(nTreg、iTreg)与B细胞体外共培养后,检测B细胞增殖(CSFE)改变,并在iTreg细胞与B细胞共培养时,分别加入Transwell小室、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂,检测B细胞增殖改变,以及iTreg细胞对B细胞凋亡(Annexin-V/FITC)的影响;为探索AOD治疗窗口期,本研究还运用磁珠分选法分离正常小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Treg(nTreg)和NaiveCD4~+T细胞,NaiveCD4~+T细胞经体外TGF-β刺激后得到iTreg细胞,分别将nTreg、iTreg经腹腔过继回输至术后1周和8周实验组小鼠,并于回输前后对卵巢组织中病理学改变进行AOD评分~([8])。研究结果1、ELISA检测术后每周小鼠外周血中性激素(E2、FSH、LH)的浓度改变,结果显示术后5~10周,实验组E2均数明显低于对照组,而FSH及LH均数明显高于对照组。2、HE及免疫组化染色后观察两组小鼠卵巢组织,结果显示:实验组小鼠在术后第3周卵巢间质中可见少许CD19~+淋巴细胞浸润,术后第5周卵巢间质中见大量CD3~+、CD19~+淋巴细胞浸润,纤维组织增生,生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多。术后5周AOD表现达到2~3级,随时间推移,逐渐加重,到第8周时已达4级。3、ELISA检测术后每周小鼠外周血中辅助T细胞炎症因子表达,结果显示:与对照组比较,实验组术后5~10周外周血TGF-β和IL-4明显降低,IFN-r和IL-21明显升高。4、流式细胞学检测分析术后1~10周、每周小鼠脾脏及盆腔淋巴结中CD4~+T细胞、Treg细胞以及B细胞亚群的动态变化,结果显示:与对照组相比,实验组CD4~+T细胞术后1~10周轻度升高;Treg细胞术后1~3周轻微升高,3周后逐渐下降,5~10周持续低于对照组;术后1周(CD138~-IgD~+)活化B细胞开始逐渐升高,并持续到第10周;(CD138~+CD19~-IgD~-)浆细胞在术后1~4周无明显变化,术后5周起逐渐升高。5、采用Pearson统计方法分析脾脏及盆腔区域淋巴结中Treg和B细胞亚群动态变化的相关性,结果显示:术后5~10周实验组脾脏及盆腔区域淋巴结中Treg与浆细胞(CD138~+CD19~-IgD~-)间无相关性(r=-0.1457,P=0.05640),而Treg与活化B细胞(CD138~-IgD~+)呈负相关性(r=-0.6622,P=0.0028)。6、磁珠分选小鼠脾脏nTreg细胞、na?ve CD4~+T细胞,流式细胞学检测细胞纯度分别为96.1%、97.5%,TGF-β体外刺激na?ve CD4~+T细胞生成iTreg细胞,细胞纯度为83.2%,流式细胞术分选B细胞,纯度为96.8%。7、将对照组B细胞以及实验组B+nTreg、B+iTreg细胞体外培养72小时后,CFSE方法检测B细胞增殖,结果显示:与对照组比较,实验组两组的B细胞增殖均显著降低,而实验组两组间无统计学差异。8、在B细胞与iTreg细胞共培养体系中,(1)间接接触培养,加入Transwell小室,分别将B细胞加入上室,iTreg细胞加入下室;(2)直接接触培养,分别加入TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂;72h后流式细胞术检测B细胞增殖情况,结果显示:与对照组比较,分别加入Transwell小室、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂三组的B细胞增殖均显著增加。9、将对照组B细胞以及实验组B+iTreg细胞体外培养16小时后,Annexin-V/FITC方法检测B细胞凋亡,结果显示:两组B细胞的凋亡无统计学差异。10、实验组术后1周及8周分别回输nTreg、iTreg,比较回输前后卵巢组织病理学变化及AOD评分,结果显示:术后1周回输iTreg和nTreg均可以有效预防AOD的发生,术后8周回输iTreg和nTreg并不能有效缓解AOD的发生。结论胸腺摘除的D3tx小鼠产生了类似人类POF的典型表现,如炎性细胞对卵巢内卵泡及间质的浸润,包括淋巴细胞,浆细胞和单核巨噬细胞,致使卵巢结构紊乱,卵泡缺失,闭锁。小鼠自身免疫性卵巢疾病始发于细胞免疫功能损害(T细胞数量和功能异常),后期卵巢中继发出现浆细胞、活化B细胞增多,并浸润于卵巢间质与卵泡,是研究免疫性卵巢早衰的良好模型。D3tx模型小鼠胸腺摘除后局部淋巴器官和组织中Treg细胞数量减损,经历了代偿性升高的短期保护性反应期,术后5周以后出现卵巢病理性改变,Treg细胞与活化B细胞呈负相关性,推测Treg细胞对B细胞的抑制作用起到了短期的保护性作用,而术后5周的Treg细胞数量减少和功能减损,导致B细胞的异常活跃,与后续的卵巢局部组织损害的发生密切相关。在后续的体外共培养体系中,验证了Treg细胞是通过细胞接触和分泌细胞因子途径来抑制B细胞增殖的。卵巢组织病理损害发生前,过继回输nTreg及iTreg细胞均能有效抑制AOD的发生,而在病理损害发生以后过继回输两组Treg细胞,均不能有效改善AOD结局。提示临床免疫性POF的治疗也应存在一定的窗口期,早期诊断非常重要。
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卵巢组织,病理学,小鼠,实验组

图1 两组小鼠血清性激素E2、FSH及LH的比较（*P<0.05，** P<0.01）2.3.2 卵巢组织形态学卵巢组织病理学及免疫组化染色观察小鼠卵巢组织病理学改变（见图2）。与对照组相比(图2A),实验组小鼠术后第5周卵巢体积明显变小,皮质中见到大量纤维组织增生,生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多(图2B);对照组卵泡及卵巢间质中可见少量CD3+(图2C)、CD19+淋巴细胞(图2E)；实验组卵泡及卵巢间质中可见明显CD3+(图2D)、CD19+淋巴细胞(图2F)。图2 两组小鼠术后第5周卵巢组织病理学及免疫组织化学分析（其中A/C/E是对照组，B/D/F为实验组，A/Bx40倍，C/D/E/Fx200倍）

性激素,小鼠血清,卵巢组织,病理学

陆军军医大学硕士学位论文20图1 两组小鼠血清性激素E2、FSH及LH的比较（*P<0.05，** P<0.01）2.3.2 卵巢组织形态学卵巢组织病理学及免疫组化染色观察小鼠卵巢组织病理学改变（见图2）。与对照组相比(图2A),实验组小鼠术后第5周卵巢体积明显变小,皮质中见到大量纤维组织增生,生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多(图2B);对照组卵泡及卵巢间质中可见少量CD3+(图2C)、CD19+淋巴细胞(图2E)；实验组卵泡及卵巢间质中可见明显CD3+(图2D)、CD19+淋巴细胞(图2F)。图2 两组小鼠术后第5周卵巢组织病理学及免疫组织化学分析（其中A/C/E是对照组，，B/D/F为实验组，A/Bx40倍，C/D/E/Fx200倍）
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.75

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