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唐氏综合征胎儿大脑海马区circRNA表达谱研究

发布时间:2020-04-03 01:45
【摘要】:唐氏综合征(Down syndrome,DS)即21三体,是导致智力障碍的最主要遗传因素之一,由21号染色体先天存在的额外拷贝引起。已有研究证实DS患者海马体中通过非编码RNA等作用介导的表观遗传学改变参与了DS导致的认知障碍。最近,一类新的非编码RNA分子--环状RNA(circular RNA,circRNA)受到了广泛的关注,circRNA具有多种分子功能,表达具有组织特异性,且在中枢神经系统中有明显富集。在神经元发育过程中,circRNA的表达受到了突触可塑性的调节,提示其具有特定的调控功能。目前DS胎儿大脑海马区的circRNA表达情况和潜在作用尚无报道。目的本研究拟采用基因芯片技术对唐氏综合征胎儿和正常二倍体胎儿大脑海马区差异性表达的circRNA进行筛选,并结合已报道的相同组织中差异表达的miRNA,mRNA数据,对circRNA与miRNA,mRNA进行关联分析和功能分析,为进一步研究circRNA在DS发生发展中的作用机制奠定基础。方法1.使用TRIzoI法提取海马组织总RNA,加入RNase-free水获得的RNA溶液用NanoDrop ND-2000测定产率和纯度,合格后于-80℃冻存。2.将RNA反转录得到First Strand cDNA及Second Strand cDNA,以Second Strand cDNA为模板合成cRNA并进行反转录,回收反转录得到的cDNA进行荧光标记反应,带有荧光基团的DNA即可用于芯片杂交,杂交结束后进行芯片清洗及扫描得到杂交图。3.使用Feature Extraction软件对杂交图片进行分析并提取数据,Agilent GeneSpring GX软件对数据进行归一化和差异分析。CircRNA差异表达标准为变化倍数(fold change,FC)32.0和校正后P值0.05,差异表达circRNA数据需进行监督性层次聚类分析。使用WebGestalt对差异表达circRNA的亲本基因进行途径和疾病内容的富集分析,miRanda和miRWalk2预测网站结合已报道的DS胎儿海马区miRNA和mRNA表达谱数据进行circRNA-miRNA-mRNA调控通路分析。4.对部分差异表达circRNA(hsa_circ_0137595;hsa_circ_0095640;hsa_circ_0137679;hsa_circ_0073296;hsa_circ_0023500;hsa_circ_0115770;hsa_circ_0115774;hsa_circ_0115775)进行qRT-PCR实验验证,并将验证结果与circRNA芯片数据进行比较。结果1.CircRNA在DS胎儿海马样本中具有差异性表达变化(FC32.0,校正后P0.05)。2.差异表达circRNA可能起到miRNA海绵的作用,进而调节DS神经病症相关的miRNA水平。3.对DE circRNA亲本基因的分析显示DE circRNA与突触小泡循环,轴突导向,长时程增强(LTP)和长期抑制(LTD)等许多神经生物学途径相关,这些途径可能导致DS患者出现学习和记忆缺陷,智能障碍以及早发性阿尔茨海默病等异常表型。4.GRIK1来源的三种DE circRNA(hsa_circRNA_0115770,hsa_circRNA_0115774和hsa_circRNA_0115775)的最终靶基因涉及轴突导向,MAPK信号传导,磷脂酰肌醇信号传导,神经胶质瘤和脑源性神经营养因子(BDNF)信号传导等多种神经发病机制有关的途径。结论CircRNA在DS胎儿海马样本中具有差异性表达变化。经预测部分DE circRNA可以调节DS神经病症相关的miRNA水平,DE circRNA的亲本基因以及GRIK1来源的三种Circ-GRIK1的最终靶基因经分析均显示其与许多神经生物学途径相关,这些作用可能导致了DS患者智能障碍等异常表型的发生。我们的研究结果为进一步阐明DE circRNA在DS患者的慢性神经退行性疾病或智力障碍中潜在的分子生物学功能提供了重要依据。
【图文】:

扫描图,扫描检测,芯片,唐氏综合征


结 果3 结果3.1 唐氏综合征海马体 circRNA 差异表达分析3.1.1 circRNA 芯片扫描图共完成14 个样品的circRNA芯片,获得DS组织芯片检测图8张 (记为DS1,DS2, DS3, DS4, DS5, DS6, DS7, DS8),二倍体对照组织芯片检测图 6 张(记为CON1, CON2, CON3, CON4,CON5, CON6)。各组芯片检测图的探针荧光信号均匀清晰,,整体背景强度低,无刮擦痕迹及水渍,芯片扫描检测图见图 3.1。

箱线图,芯片,归一化,样本


结 果张。3.1.2 circRNA 芯片质控结果对样本芯片探针荧光信号数据和分位数进行归一化处理后绘制箱线图(boxplot),展示了不同样本归一化处理后的总体表达情况。在 14 张芯片中(8 例唐氏组织 DS1, DS2, DS3, DS4, DS5, DS6, DS7, DS8;6 例二倍体对照组织 CON1,CON2, CON3, CON4,CON5, CON6),circRNAs 表达谱归一化后不同样本总体荧光信号强度趋于同一水平,见图 3.2。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R714.5

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