子痫前期合并胎儿生长受限患者胎盘组织HSP70高表达通过NO系统影响胎儿宫内发育的机制探讨

发布时间：2020-04-05 02:05

【摘要】：背景:子痫前期(preeclampsia,PE)是一种妊娠期特发疾病,在临床上表现为多种严重的症状,患者胎儿营养受限,多伴有胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR),同时累及母体的多个器官、严重威胁着母亲和胎儿的健康。子痫前期的妇女FGR的发病率比正常孕妇高2-3倍,发生时间越早,导致胎盘缺血及胎儿宫内缺氧状态越严重,发生FGR的危险性越大,胎儿预后往往不良。临床研究显示,正常妊娠时孕妇外周血中循环热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)水平降低,且与孕周呈正相关,与孕妇年龄呈负相关。而妊娠哮喘、早产、子痫前期、FGR等病理性妊娠中,孕妇循环中HSP70增加,提示HSP70可能与胎儿发育和妊娠期相关疾病有关。但是循环中过表达的HSP70如何诱发FGR的具体机制尚不清楚。研究人员发现HSP70可激发内源性一氧化氮途径,抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)基因转录及合成,降低iNOS的活性,使细胞内一氧化氮(nitric oxide,NO)合成减少。那么,胎盘和外周血中上调表达的HSP70是否是通过影响iNOS和/或内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)使得相关血管的NO合成减少,进而影响胎儿宫内发育,还未知。因此,我们通过以下三个部分进行研究:(1)分析外周血HSP70和NO的水平与子痫前期合并FGR疾病之间的关系;(2)建立人绒癌细胞株JEG-3细胞与人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞共培养体系并探讨不同表达水平HSP70的JEG-3细胞对HUVEC细胞的影响;(3)胎盘和外周血中HSP70蛋白表达变化对胎鼠宫内发育的影响。通过上述3个部分的研究,证实循环中HSP70的过表达与子痫前期合并FGR相关,其可能是通过影响胎儿血液循环脉管系统中iNOS的表达,抑制内皮细胞中NO的合成从而导致胎儿血供不足。本实验从整体和细胞水平分析循环中HSP70过表达与子痫前期合并FGR之间的关系,为临床子痫前期合并FGR的防治提供实验依据。目的:1.分析外周血HSP70和NO的水平,分析其与子痫前期合并FGR孕妇之间的关系。2.建立JEG-3与HUVEC共培养体系并探讨不同表达水平HSP70的JEG-3细胞对HUVEC细胞的影响。3.通过寒冷刺激建立动物模型,再人为诱导或干扰孕鼠循环中HSP70的表达,探讨HSP70蛋白表达变化对胎鼠宫内发育的影响及其机制。方法:1.选取临床诊断为子痫前期的病例,收集子痫前期(30例)、子痫前期合并FGR(25例)和正常妊娠妇女(50例)胎盘和外周血。测量外周血中HSP70和NO的水平,比较各组孕妇外周血中HSP70含量,NO水平及胎盘组织HSP70的表达变化,探讨HSP70蛋白表达与子痫前期合并FGR之间的关系。2.将与胎盘滋养细胞生物学特性相近的人绒癌细胞株-JEG-3细胞与人脐静脉内皮细胞株-HUVEC细胞共培养于孔径0.4μm的6孔培养板的Transwell共培养系统中,观察HUVEC细胞增值率,细胞凋亡及细胞周期的影响,来探讨不同水平HSP70的JEG-3细胞对HUVEC的影响,为子痫前期合并FGR的发病机制提供实验理论依据。3.通过寒冷刺激建立子痫前期动物模型来模拟子痫前期孕妇的病理生理特点,同时,在孕15天时通过尾静脉注射慢病毒,至妊娠结束,观察胎儿和胎盘的发育情况,来探讨HSP70的表达变化对子痫前期胎儿的影响,为子痫前期的早期防治提供实验依据。结果:1.第一部分研究结果:子痫前期合并FGR孕妇外周血的HSP70表达与子痫前期组及正常妊娠组相比显著升高(P0.05),子痫前期合并FGR孕妇外周血的NO(31.47±3.65μmol/L)表达与正常对照组(57.65±5.73μmol/L)相比显著降低(P0.05)。Western blotting结果显示,子痫前期合并FGR孕妇胎盘组织中HSP70的表达与正常对照相比明显升高。2.第二部分研究结果:HSP70慢病毒感染JEG-3细胞后,收集细胞进行Western blotting结果表明,与阴性病毒对照组相比,感染靶向干扰HSP70慢病毒的JEG-3细胞其HSP70的表达显著降低(P0.05)。同时,当用Flag抗体检测时只有过表达病毒感染细胞有条带,改用HSP70抗体检测后过表达组出现了内源性和外源性双条带,这同时证明HSP70的表达显著升高(P0.05)。这些表明,病毒感染JEG-3细胞后HSP70蛋白表达水平相应的增加和抑制了HSP70基因的表达。HUVEC细胞在单独培养时呈梭型,排列成铺路石样外观。共培养后形态未观察到明显变化。HUVEC细胞与HSP70低水平表达的JEG-3细胞共培养后,细胞内NO含量与阴性对照组相比升高但无显著性差异(P0.05);当HUVEC细胞与HSP70高水平表达的JEG-3细胞共培养后,细胞内NO含量与阴性对照组相比又明显降低(P0.05)。这些结果说明,不同HSP70表达水平的JEG-3与HUVEC细胞共培养后,能够通过某些细胞因子影响HUVEC细胞内NO的表达;当HSP70低水平和高水平表达的JEG-3细胞分别于HUVEC细胞共培养后,收集细胞后通过CCK-8方法检测各组细胞增值率。我们发现,各处理组与对照组相比,其细胞增值率均无显著性差异。这说明不同水平HSP70表达的JEG-3与HUVEC共培养后不会影响HUVEC细胞增值率。HUVEC与不同处理的JEG-3共培养后,通过Annexin V-FITC/PI双标法,经过流式细胞术可以检测出各组细胞的凋亡情况。与对照组相比,共培养后的HUVEC细胞凋亡水平没有明显改变,差异无统计学意义(P0.05)。这一结果说明,HSP70表达水平改变的JEG-3与HUVEC共培养后不会影响HUVEC细胞凋亡水平;HUVEC与不同处理的JEG-3共培养后,通过PI染色法检测各组细胞周期。与对照组相比,共培养后的HUVEC细胞周期没有明显改变,差异无统计学意义(P0.05)。这一结果说明,HSP70表达水平改变的JEG-3与HUVEC共培养后不会影响HUVEC的细胞周期;Western blotting结果显示,HUVEC与HSP70低表达JEG-3细胞共培养后,iNOS、eNOS和HSP70蛋白水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。当HUVEC与HSP70高表达JEG-3细胞共培养后,我们发现iNOS蛋白与对照组相比,表达显著降低(P0.05),而eNOS和HSP70表达无显著性差异。3.第三部分研究结果:各组孕鼠的胎死率和产仔量没有显著差异,虽然干扰对照和过表达对照组的活胎总数有升高的趋势,但与其它组相比无统计学差异(均P0.05),这可能与孕鼠的个体差异有关。各实验组胎鼠身长、胎盘重量的组间比较差异均无统计学意义(均P0.05);HSP70干扰表达组的胎鼠体重明显高于对照组与过表达组,且差异均有统计学意义(P0.05);HSP70干扰表达组的胎盘重量低于对照组,比较差异同样有统计学意义(P0.05);4.孕鼠血浆中NO的含量比较:与正常对照组相比,寒冷刺激模型组孕鼠外周血中的NO含量明显降低(P0.05);与干扰对照组相比,HSP70干扰表达组的孕鼠外周血中的NO含量显著升高,差异有统计学意义(P0.05);而过表达组孕鼠外周血NO含量低于对照组但差异无统计学意义(P0.05)。胎盘HSP70表达的比较:Western blotting结果显示,寒冷刺激模型组与正常组相比,HSP70表达显著升高(P0.05);干扰表达组的HSP70与对照组相比降低,差异有统计学意义(P0.05);过表达组与多表达对照相比显著性升高(P0.05)。脐带组织中eNOS和iNOS表达的比较:寒冷刺激模型组与正常组相比,eNOS和iNOS表达均显著降低(P0.05),这与外周血中NO含量降低结果相符;干扰组中,与对照组相比,其组织中eNOS和iNOS表达均升高,差异具有统计学意义;过表达组中,与对照组相比,eNOS表达无明显改变,而iNOS表达显著降低(P0.05),这可能是由于过多的HSP70使得诱导型一氧氮合酶iNOS显著降低,导致内皮细胞补偿性的升高内源性eNOS的表达。结论:1.胎盘和外周血中HSP70的水平升高很可能与子痫前期合并FGR的发病过程密切相关。2.JEG-3细胞内过表达的HSP70与HUVEC细胞共培养后能够抑制HUVEC细胞内iNOS的表达水平,进而减少胞内NO的含量。3.JEG-3细胞内异常表达的HSP70与HUVEC细胞共培养后并不能改变其细胞增值率,细胞凋亡及细胞周期。4.寒冷刺激动物模型中胎鼠体重与正常组相比显著降低,且胎盘组织中HSP70表达显著升高,脐带组织中一氧化氮合酶表达显著降低。5.通过抑制胎盘中的HSP70表达,有助于缓解胎鼠的发育。
【图文】：

和子,外周血,水平表,对照组

第一部分子痫前期合并 FGR 孕妇外周血 HSP70(HSPA1A)和 NO 的水平表 1.2 正常妊娠和子痫前期及子痫前期合并 FGR 外周血 NO 的含Tab1.2 The content of NO in each group：a,与对照组比较，P＜0.05;例数(n)外周血 NO 含量(μmol/L)正常对照 50 57.65±5.73子痫前期 10 43.56±3.45痫前期合并FGR 18 31.47±3.65a

孕妇,和子,胎儿体重,学说

经超声评估的胎儿体重低于相应孕周应有胎儿体重的百分位数属于严重 FGR[29]。我国 FGR 的发病率是 6%R 可致低出生体重、胎儿缺氧、新生儿窒息、死胎、胎响神经行为发育，并增加代谢综合征的发生风险[29]。随妊娠期高血压疾病，，如子痫前期合并 FGR[31]。子痫盘的功能，以及胎儿的生长造成影响，床上表现为多营养受限，多伴有 FGR，严重威胁着母亲和胎儿的健是多因素的，其中被认可的是血管内皮损伤学说、遗缺血缺氧学说和滋养细胞凋亡调节异常学说等。 Roberts[32]提出的二阶段理论假说认为：第一阶段胎图 1.2 正常妊娠和子痫前期合并 FGR 孕妇胎盘组织中 HSP7Figure 1.2 Expression of HSP70 in placenta tissue of pregnanwith or without preeclampsia combined with FGR
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.244;R714.5

【参考文献】