SIRT1通过PARP1信号通路参与宫颈癌耐药性的体内实验研究

发布时间：2020-04-24 07:55

【摘要】：目的:沉默信息调节因子1(silent information regular1,SIRT1)系sirtuin家族成员之一,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的III类组蛋白去乙酰化酶,可参与细胞增殖、凋亡、代谢以及应激反应等生命过程。研究证实SIRT1在多种肿瘤中异常表达且与肿瘤耐药有关。本研究应用靶向SIRT1的RNA干扰慢病毒重组载体分别在细胞水平及动物水平研究SIRT1-shRNA对人宫颈癌Hela细胞移植瘤生长的影响,进一步探讨沉默SIRT1对宫颈癌顺铂敏感性的影响及其与耐药相关蛋白之间的关系。方法:分别构建三个携带不同SIRT1靶点的RNA干扰慢病毒重组载体,感染人宫颈癌Hela细胞,筛选出抑制率最高的RNA干扰慢病毒重组载体用于后续实验。细胞水平试验分为6组:空白Hela细胞对照组、慢病毒阴性对照组、转染试剂polybrene组、SIRT1-shRNA组、顺铂组和SIRT1-shRNA联合顺铂组,CCK-8法测定Hela细胞的增殖抑制率。动物试验采用3~4周龄雌性裸鼠,分为5组:空白Hela细胞组、慢病毒阴性对照组、SIRT1-shRNA组、顺铂组和SIRT1-shRNA联合顺铂组。分别于右侧腋部皮下注射6×10~6个空白Hela细胞悬液、阴性慢病毒感染的Hela细胞悬液及SIRT1-shRNA感染的Hela细胞悬液。造模成功后,待移植瘤瘤体长度达7cm,顺铂组和SIRT1-shRNA联合顺铂组裸鼠腹腔注射顺铂(2mg/kg,200μl),每周两次,共计三周。每3d测量一次裸鼠重量以及瘤体体积,绘制裸鼠肿瘤的生长曲线。顺铂治疗结束后3d,处死裸鼠、称重,剥离裸鼠皮下肿瘤组织并测量和称重。HE染色观察裸鼠肿瘤组织的病理学变化;免疫组织化学染色法观察SIRT1在裸鼠肿瘤组织内的表达;Western blot检测SIRT1以及耐药相关蛋白PARP1、DNA-PKcs和ABCC1的表达。结果:经反复实验优化,SIRT1-shRNA-2号慢病毒载体在MOI=20,polybrene=6μg/ml完全培养基的条件下,细胞感染率90%,存活率95%,为慢病毒的最佳感染条件。CCK-8结果显示:与空白Hela细胞对照组相比,polybrene组和慢病毒阴性对照组细胞抑制率分别为5.7%和11.2%,差异没有统计学意义(P0.05),而SIRT1-shRNA组与顺铂组细胞抑制率分别为65.2%和21.6%,差异具有统计学意义(P0.05)。体内实验结果证明各组裸鼠移植瘤成瘤率为100%,裸鼠移植瘤曲线结果显示:与空白Hela细胞组瘤体相比,慢病毒阴性对照组差异没有统计学意义(P0.05),而SIRT1-shRNA与顺铂组瘤体体积均明显缩小(P0.05),SIRT1-shRNA联合顺铂组裸鼠瘤体的抑制作用最为明显(P0.05)。HE染色结果显示:在SIRT1-shRNA组、顺铂组和SIRT1-shRNA联合顺铂组中移植瘤细胞出现明显的细胞形态学改变,表现为核固缩、碎裂,肿瘤细胞体积缩小以及出现坏死和凋亡等。免疫组织化学染色法结果显示:在SIRT1-shRNA组和SIRT1-shRNA联合顺铂组中,SIRT1蛋白表达明显下调。Western Blot结果表明:与空白Hela细胞对照组相比,SIRT1-shRNA组和SIRT1-shRNA联合顺铂组SIRT1与ABCC1蛋白表达水平明显下调(P0.05),而SIRT1-shRNA组、顺铂组和SIRT1-shRNA联合顺铂组PARP1与DNA-PKcs蛋白表达水平明显上调(P0.05)。结论:慢病毒介导靶向SIRT1的shRNA可以显著抑制Hela细胞SIRT1蛋白的表达及Hela细胞的增殖。在裸鼠体内,SIRT1通过上调与宫颈癌耐药相关蛋白PARP1、DNA-PKcs的表达,并下调ABCC1蛋白的表达影响宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性。
【图文】：

结果结 果A 慢病毒感染 Hela 细胞条件的优化的靶向 SIRT1 的 shRNA 慢病毒载体，将携带不同 S体及 shRNA 阴性对照慢病毒载体分别感染 Hela 细胞 Hela 细胞对照组相比，慢病毒阴性对照组 SIRT1 蛋白，而三组SIRT1-shRNA干扰组SIRT1蛋白表达水平均明T1-shRNA（25072-1, GGCTTGATGGTAATCAGTA）感列慢病毒，，慢病毒感染条件采用本实验室前期研究l 的完全培养基（图 1）。

青岛大学硕士学位论文IRT1-shRNA 联合顺铂对 Hela 细胞增殖的影响将 SIRT1-shRNA 与 3μM DDP 联合作用于 Hela 细胞，CCK-8 结果显示：与空白对照组相比，SIRT1-shRNA 组与 DDP 组 Hela 细胞的增殖率明显降低（P<0.0 SIRT1-shRNA 联合 DDP 组 48h 抑制率高达 84.3%，而转染试剂 polybrene 组、性对照组和空白 Hela 细胞对照组相比，差异没有统计学意义（图 2，P>0.05）
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王露;朱哲慧;陈思敏;赖仁胜;;小细胞肺癌分子标志物PARP1的研究进展[J];中国医药导报;2012年35期

2 赵岩;林添雨;孙茹;韩延龙;米东辉;曾宪录;巴雪青;;抑制PARP1活性对博来霉素诱导的肺纤维化的改善作用[J];吉林大学学报(医学版);2015年03期

3 罗皓;杨博;何乐;张诗珩;戴楠;李梦侠;王东;;PARP1和APE1在三阴乳腺癌中表达的相关性及临床意义[J];现代医药卫生;2018年23期

4 张右梓;刘笑;周一凡;张增辉;;基于丙氨酸扫描与相互作用熵方法的PARP1与配体的结合自由能计算[J];中国科学:化学;2018年02期

5 许开武;秦长江;陈志辉;宋新明;;PARP1在结直肠癌的表达及对SW620增殖与凋亡的影响[J];消化肿瘤杂志(电子版);2013年04期

6 李炜娟;肖元梅;;PARP1在氧化应激诱导的DNA损伤及其修复过程中的作用[J];中国老年学杂志;2015年23期

7 陈机琼;冯慧艳;林丹丽;黄嘉琴;蔡美婷;李玉荣;;PARP1在三阴性乳腺癌组织中的表达及其与EMT的相关性[J];现代肿瘤医学;2020年03期

8 于文亮;贾媛黎;张勇;;PARP1基因抑制对卵巢癌细胞增殖及耐药性的影响[J];中国医药指南;2012年29期

9 张秀伟;钟文;魏士博;温健;;三阴性乳腺癌与PARP1表达相关性的Meta分析[J];现代肿瘤医学;2017年06期

10 凌兵;冯林;程书钧;;DENND2D通过调控PARP1对非小细胞肺癌细胞系H1299中顺铂细胞毒性的影响[J];癌变·畸变·突变;2013年02期

相关会议论文 前2条

1 陶功华;龚春梅;杨淋清;刘庆成;肖萍;庄志雄;;苯并[a]芘诱发16HBE细胞恶性转化过程中PARP1组蛋白修饰模式研究[A];中国毒理学会第三届中青年学者科技论坛暨2011年全国前列腺药理毒理学研讨会论文集[C];2011年

2 符雷蕾;姚大红;欧阳亮;;基于晶体结构设计全新PARP1抑制剂的合成及在三阴性乳腺癌中诱导凋亡机制的研究[A];中国药学会第十三届青年药学科研成果交流会论文集[C];2016年

相关博士学位论文 前4条

1 徐树建;miR-891b靶向沉默PARP1增加乳腺癌细胞对烷化剂药物的敏感性[D];山东大学;2018年

2 翟丽丽;乳腺癌PARP1表达与PARP1基因启动子、3’非翻译区域多态性及患者化疗敏感性的相关性研究[D];天津医科大学;2014年

3 肖满;let-7e通过抑制PARP1介导的DNA损伤修复增加卵巢癌对顺铂的敏感性[D];华中科技大学;2017年

4 柯悠;Caspase-1介导的PARP1激活在肾小管间质纤维化中的作用及机制[D];华中科技大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙哲;SIRT1通过PARP1信号通路参与宫颈癌耐药性的体内实验研究[D];青岛大学;2019年

2 张右梓;基于丙氨酸扫描与相互作用熵方法的PARP1与配体的结合自由能计算[D];华东师范大学;2019年

3 韩数;电针对大鼠急性脊髓损伤PARP1的影响[D];黑龙江中医药大学;2009年

4 朱晓蕾;嘧啶酮类/7-氮杂吲哚类/呔嗪酮类PARP1抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究[D];浙江大学;2013年

5 林丽容;基于果蝇RNA干扰系研究Parp1基因运动抗心脏衰老功能[D];湖南师范大学;2014年

6 侯栋;PARP1在卵巢癌的表达及抗氧化作用研究[D];山东大学;2015年

7 关家伟;PARP1协同PTEN在DNA损伤修复NHEJ通路中作用的研究[D];大连医科大学;2017年

8 张彩霞;白术内酯Ⅱ促进大肠癌Lovo细胞凋亡及对PARP1和caspase-3表达的影响[D];南京中医药大学;2017年

9 李永玲;Purα对PARP1基因表达调控作用及在DNA损伤修复中作用机制研究[D];宁夏医科大学;2016年

10 赵万;BER通路基因多态性与晚期非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性的关系[D];南京医科大学;2011年

本文编号：2638713