卵巢癌ID8癌干样细胞分离鉴定及其疫苗效应研究

发布时间：2020-04-28 08:01

【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer,OC)是妇科系统最常见的恶性肿瘤之一,其中上皮卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是OC最主要的病理类型,占OC的85%。由于OC易耐药转移及复发,致使其病死率高居妇科恶性肿瘤的首位。传统的治疗效果并不理想,就其原因是肿瘤组织中存在小部分的肿瘤干细胞或癌干细胞(cancer stem cell,CSC),其具有无限增殖、自我更新、分化及耐受放化疗等能力,是肿瘤拮抗放化疗、复发和转移的根源。因此,寻找新的治疗策略治疗OC是至关重要的。近年来,随着肿瘤免疫学、细胞生物学和分子技术等研究不断深入,肿瘤免疫治疗逐渐兴起。肿瘤免疫治疗是通过激发机体产生肿瘤特异性免疫应答,充分发挥其抑制和杀伤肿瘤功能的治疗方法。目前肿瘤免疫治疗主要包括免疫检测点阻断、过继性输注免疫活性细胞和肿瘤疫苗等,经实验研究和临床应用已经证实这些治疗能够较为明显的改善疾病预后。然而,由于CSC及其分化的子代所表现出不同的基因表达谱系继而表达出不同的抗原,所以普通的肿瘤免疫治疗并不能有效地杀灭CSC,可导致CSC残余富集。因此,有效靶向CSC的免疫治疗是消灭肿瘤、防止复发的关键。目前,有观点认为CSC富集多种的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原,以完整的CSC的裂解产物作为肿瘤免疫的疫苗,可能会激发宿主免疫系统产生特异性靶向CSC的免疫反应。因此,卵巢癌CSC疫苗是一个值得研究的免疫治疗策略。本研究选择小鼠上皮卵巢癌细胞系ID8细胞,通过无血清培养法(serum free medium,SFM)富集并鉴定细胞系ID8的卵巢癌干样细胞(OCSC)。然后将富集的ID8 OCSC制备成疫苗免疫C57BL/6小鼠,研究其抗肿瘤效应及机制。目的:分选鉴定鼠源性上皮卵巢癌细胞系ID8的OCSC,并以此为基础,探讨OCSC瘤苗抗肿瘤效应及机制,为以OCSC瘤苗治疗卵巢癌提供实验依据。方法:1.应用SFM培养小鼠卵巢癌ID8细胞,将获得ID8悬浮球细胞传代扩增。体外采用CCK8法、平板克隆、Transwell小室迁移侵袭及药敏实验观察悬浮球细胞与常规培养的ID8细胞在生物学功能上的差异,并通过小鼠致瘤实验比较两者的体内成瘤能力。最后应用Real-time PCR以及Western blot检测两者细胞系和瘤组织中OCSC标志乙醛脱氢酶1(ALDH1)的表达情况。2.取2×10~5个SFM培养的ID8 OCSC,经反复冻融灭活后免疫C57BL/6小鼠,每次间隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6个ID8细胞攻击免疫鼠。同时设ID8细胞瘤苗组为对照,以上述同样的方法免疫和攻击小鼠。观察各组小鼠生存和肿瘤生长情况,并通过检测免疫小鼠血清细胞因子,补体依赖的细胞毒活性(CDC)、脾细胞及NK细胞毒活性,比较OCSC瘤苗与普通瘤苗的抗肿瘤效果差异。3.应用Real-time PCR和Western blot检测ID8细胞和ID8 OCSC中的肿瘤优势抗原即受体酪氨酸激酶孤儿受体1型(ROR1)分子表达差异。并设计针对小鼠ROR1靶基因序列的短发夹RNA(shRNA)序列,构建重组质粒进行慢病毒包装,并使用倍比稀释法测定病毒滴度。之后将含有shROR1表达载体的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,最后应用Real-time PCR和Western blot分析ID8细胞中ROR1分子下调情况。4.取2×10~5个SFM培养的shROR1-ID8 OCSC经反复冻融灭活后免疫C57BL/6小鼠,每次间隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6个ID8细胞攻击免疫鼠。同时设ID8细胞瘤苗组和ID8 OCSC瘤苗组为对照,以上述同样的方法免疫和攻击小鼠。观察各组小鼠生存和肿瘤生长情况,通过小鼠肿瘤生成时间及肿瘤体积的大小,初步探讨OCSC瘤苗抗肿瘤效应的分子机制。结果:1.小鼠卵巢癌ID8细胞能在SFM中形成可稳定传代的悬浮球细胞,其与非悬浮球细胞相比,具有较强的增殖、自我更新、迁移、侵袭、耐药及致瘤的能力。同时,ID8悬浮球细胞及其瘤组织中高表达CSC标志ALDH1。2.与ID8瘤苗组相比,ID8悬浮球制备的OCSC瘤苗组的小鼠成瘤潜伏期长,肿瘤生长速度较慢,具有显著性的差异。经检测发现ID8 OCSC瘤苗组小鼠血清IFN-γ水平,CDC活性、脾细胞及NK细胞毒活性均较ID8瘤苗组高。同时ID8 OCSC瘤苗免疫鼠血清中TGF-β1表达明显降低。3.ROR1分子在ID8 OCSC中高表达,与ID8细胞相比,差异具有统计学意义。重组质粒的DNA测序结果显示与预期DNA序列吻合;滴度测定表明shROR1慢病毒载体构建成功。含有shROR1慢病毒的ID8细胞中ROR1表达下降。4.应用反复冻融法制备shROR1-ID8 OCSC瘤苗免疫C57 BL/6小鼠后,较ID8OCSC瘤苗免疫组而言,shROR1-ID8 OCSC瘤苗组小鼠成瘤时间短且肿瘤生长速度快,差异具有统计学意义。结论:应用SFM培养法能有效富集具有OCSC特征的上皮卵巢癌ID8悬浮球细胞,用其制备的瘤苗,具有更强的免疫原性,能够有效的诱导小鼠产生特异性的细胞及体液免疫反应,显示出有效的抗肿瘤效应;其效应机制与OCSC高表达ROR1免疫分子激发小鼠强免疫反应相关。该发现为以ID8 OCSC瘤苗防治卵巢癌提供可参考的实验依据。
【图文】：

形态图,形态图,倒置显微镜,悬浮球

ID8细胞在SSM中呈梭型单层贴壁生长，而在含有细胞因子的SFM中，部分ID8细胞悬浮增生，呈球形或者椭圆形，悬浮球内的细胞结合紧密、球体饱满且球内细胞折光性好（图1-1）。表明ID8细胞在无血清培养条件下能够存活并增殖形成具有自我更新能力的肿瘤细胞球。图1-1 倒置显微镜下细胞形态图（×100）Figure 1-1 The cell growth observed under microscope (×100)A：ID8细胞（ID8 cell） B：ID8悬浮球细胞（ID8 sphere cell）2 CCK-8增殖实验采用CCK8法连续7天检测ID8细胞和悬浮球细胞增殖的情况，并绘制出细胞的生长曲线。结果显示，从培养的第4天开始，悬浮球细胞组的吸光值明显高于常规培养的ID8细胞组（P＜0.01，图1-2），表明相对于ID8细胞，悬浮球细胞具有更强的增殖能力。图1-2 两组细胞增殖能力的检测Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：两组细胞连续7天测量的OD值 B：两组细胞连续7天增殖曲线图（**p <0.01,***p <0.

悬浮球,细胞,吸光值,细胞增殖

采用CCK8法连续7天检测ID8细胞和悬浮球细胞增殖的情况，并绘制出细胞的生长曲线。结果显示，，从培养的第4天开始，悬浮球细胞组的吸光值明显高于常规培养的ID8细胞组（P＜0.01，图1-2），表明相对于ID8细胞，悬浮球细胞具有更强的增殖能力。图1-2 两组细胞增殖能力的检测Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：两组细胞连续7天测量的OD值 B：两组细胞连续7天增殖曲线图（**p <0.01,***p <0.001）
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31;R730.51

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