CYC1对浆液性卵巢癌生物学行为影响及其机制

发布时间：2020-05-04 23:54

【摘要】：研究目的及背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,浆液性卵巢癌(SOC)占卵巢上皮癌绝大部分,其中高级别浆液性癌,恶性程度较高,预后较差。卵巢癌患者经治疗后,往往存在化疗复发、多重耐药的情况。因此,研究卵巢癌发病机制,发现早期监测指标尤为重要,可以为进一步指导临床治疗打下基础。CYC1(Cytochrome c-1)是线粒体复合体III的重要亚单位,在生物氧化过程中,可发生组织氧化还原的迅速酶促作用。CYC1在乳腺导管原位癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤和骨肉瘤等癌症中均高表达。CYC1可参与线粒体依赖的凋亡途径,抑制AMPK的活化,促进肿瘤的增殖转移。本研究通过基因表达谱测序和蛋白质谱检测技术,发现浆液性卵巢癌中CYC1表达明显高于输卵管伞,利用组织芯片TMA发现CYC1高表达与卵巢癌的不良预后相关。通过一系列的功能实验验证CYC1的功能,发现其在SOC中发挥促肿瘤浸润转移、增殖、调控细胞周期和化疗耐药作用。同时通过高通量测序技术,发掘了 CYC1的发挥功能下游分子机制,探讨了其潜在结合的分子及相关信号通路。研究方法:1.收集正常输卵管伞(FT)及浆液性卵巢癌(SOC)组织,RT-qPCR和Western Blot检测组织中CYC1表达。对组织芯片(3张)免疫组化染色,统计CYC1的表达与预后关系。2.构建CYC1过表达及降表达的稳定细胞系。以MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移能力,流式细胞术检测细胞周期进程,Western Blot检测细胞周期及EMT相关蛋白。3.对细胞进行一定浓度梯度的顺铂、奥拉帕尼刺激,检测CYC1蛋白表达量,MTT法测细胞增殖能力,平板克隆验证细胞的长期增殖能力。TUNEL法与流式细胞术结合,检测CYC1对细胞凋亡的影响。4.RNA-seq法寻找CYC1发挥功能的下游分子机制,对丰度较高的基因进行Western Blot 及 RT-qPCR 验证。研究结果:1.CYC1在SOC中mRNA及蛋白表达明显高于输卵管伞,TCGA数据集分析发现CYC1在的SOC中存在异常拷贝数扩增,拷贝数的扩增与CYC1的蛋白和mRNA的表达相关。2.通过免疫组织化学分析TMA中CYC1的表达水平,CYC1高表达患者总生存期短,CYC1高表达与SOC的不良预后相关。3.CYC1增强SOC细胞的增殖能力,通过MTT生长曲线及平板克隆实验,证明过表达CYC1促进细胞增殖,干扰CYC1后抑制细胞增殖。降表达CYC1阻滞细胞在G1→S期,CYC1过表达则引起G0/G1期向S期转化。干扰CYC1后,抑制周期相关蛋白CCNB1、CCNE1、CDKs表达,而促进p21,p27依赖性激酶抑制剂蛋白。4.CYC1促进浆液性卵巢癌细胞的侵袭迁移能力,降表达CYC1,减弱HO8910细胞和A2780细胞的侵袭、迁移能力,过表达促进细胞的侵袭、迁移能力。干扰CYC1后,上皮性蛋白标志物表达升高,间质性蛋白标志物表达降低,EMT相应转录因子MMP9、Snail、Slug表达均降低。5.CYC1的高表达促进人卵巢癌皮下移植瘤生长,CYC1过表达组瘤体平均重量显著高于对照组,免疫组化染色表明CYC1过表达组中细胞增殖标记物Ki-67表达增加。6.CYC1促进SOC化疗耐药,顺铂处理明显提高CYC1蛋白表达水平,耐药MTT实验显示过表达CYC1,促进A2780、SKOV3和HO8910细胞增殖;平板克隆实验显示,干扰CYC1降低细胞长期生长活力。降表达CYC1后,凋亡相关蛋白表达增高,早期及晚期凋亡细胞增加,说明CYC1通过抑制凋亡发挥耐药作用。7.沉默CYC1增敏奥拉帕尼对BRCA野生型卵巢癌细胞作用,在SKOV3和A2780细胞中,奥拉帕尼处理条件下,降表达CYC1明显降低细胞存活率。8.RNA-Seq测序结果显示,CYC1调控多种重要通路下游分子表达。RT-q PCR结果表明,A2780细胞中干扰CYC1后,CCNE2和BIRC3表达显著下降,此外,FGF18、EGFR、WNT5B、NFKBIA 和 FZD4 表达均有下降。Western Blot表明降表达CYC1后,CCNE2和BIRC3蛋白表达量降低。研究结论:1.CYC1在浆液性卵巢癌中表达明显高于输卵管伞,与SOC不良预后相关。2.CYC1作为卵巢癌不良预后因子,促进浆液性卵巢癌的恶性生物学行为,是卵巢癌潜在治疗靶点。3.CYC1促进SOC对化疗耐药,降表达CYC1可以增加化疗作用敏感性。4.CYC1通过调控CCNE2和BIRC3等多种重要分子发挥促癌作用。
【图文】：

图１．浆液性卵巢癌中ＣＹＣ１氋表达逡逑（Ａ－Ｂ）ＣＹＣｌ蛋白在Ｓ０Ｃ中的组织表达，，与输卵管伞相比增高。（Ｃ）卵巢癌细胞逡逑系中ＣＹＣ１蛋白表达ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析。（Ｄ）ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＣＹＣ１在ＨＧＳ０Ｃ逡逑及输卵管伞中的ｍＲＮＡ水平的表达。（Ｅ）邋Ｏｎｃｏｍｉｎｅ数据库中ＣＹＣ１邋ｍＲＮＡ水逡逑平差异。分为浆液性卵巢癌、卵巢表面浆液性乳头状癌组，对照为正常腹膜和正逡逑常卵巢表面上皮。（Ｆ）ＣＹＣ１表达量在ＴＣＧＡ数据库中分析，正常上皮组表达量逡逑小于浆液性卵巢癌组（Ｐ＜0．0５）。逡逑４０逡逑

图２．ＣＹＣ１拷贝数的扩增与其表达相关逡逑（Ａ）ＴＣＧＡ数据库分析ＣＹＣｌ在浆液性卵巢癌中拷贝数的变化。（Ｂ）邋ＣＹＣｌ拷贝逡逑数变化在蛋白水平和ｍＲＮＡ水平的相关性，ＣＹＣ１拷贝数变化以扩增型为主。（Ｃ）逡逑ＴＣＧＡ数据分析ＣＹＣｌ拷贝数变化类型与ｍＲＮＡ及蛋白表达的相关性。逡逑（Ｄ－Ｅ）ＣＣＬＥ数据集分析ＣＹＣｌ在卵巢癌４７种细胞系中，拷贝数变化与ｍＲＮＡ及逡逑蛋白表达相关性（ｒ＝０．６２５７，邋ｐ＜０．００ｌ）。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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本文编号：2649178