高表达CYR61人子宫内膜血管旁细胞在促进大鼠子宫全层损伤的修复中的作用

发布时间：2020-05-06 23:57

【摘要】：目的:构建大鼠部分子宫全层损伤模型,并移植胶原支架/高CYR61水平的人子宫内膜血管旁细胞(endometrial perivascular cells,En-PSCs),观察其对子宫损伤部位结构和功能的影响。方法:首先通过流式细胞术从子宫内膜单细胞悬液中分选出人En-PSCs。然后分别用CYR61特异性小干扰核糖核酸(si-CYR61)、过表达质粒转染产生低表达的人EnPSCs(si-CYR61 En-PSCs)及高表达CYR61的人En-PSCs(ov-CYR61 En-PSCs)。将转染后产生的不同CYR61水平的En-PSCs与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养进行成环和迁移实验。Sprague-Dawley(SD)大鼠子宫中段系膜对侧切除长1.5cm、宽0.5cm的子宫壁建立部分子宫全层损伤的大鼠模型。将正常SD雌性大鼠随机分为5组:sham组(仅开腹,子宫无损伤)及4个修复组。修复组分为Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组,Collagen/si-CYR61 EnPSCs组和Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组。分别将不同CYR61水平的En-PSCs/胶原支架复合物缝合在相应组的受损子宫组织部位。术后30d和90d,分别收集每组大鼠子宫组织,制作石蜡切片,进行苏木精和伊红染色及免疫组织化学方法染色,以观察子宫受损部位内膜、平滑肌及血管的恢复状况。术后90d,在2w内,将各组剩余大鼠在发情期与成年可育的SD雄性大鼠交配,观察子宫及受损部位妊娠功能的恢复状况。结果:分选的En-PSCs表达已知的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)标志物(CD13,CD44,CD73,CD90和CD105),不表达造血系标志物(CD34,CD45,CD56,CD144和HLA-DR)。且En-PSCs具有向脂肪细胞、骨细胞和神经元样细胞分化的潜能,表明En-PSCs是一种MSCs。成环和迁移实验表明,ov-CYR61 En-PSCs能够促使HUVECs成环并促进其迁移。动物实验结果表明,术后30d:Collagen/ovCYR61 En-PSCs组的子宫内膜厚度显著高于Collagen/En-PSCs组,Collagen/En-PSCs组显著高于Collagen/PBS组;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组子宫再生部位的α-SMA阳性面积百分比显著高于Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组与Collagen/PBS组相比则无统计学差异;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组子宫再生部位的血管密度显著高于Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组显著高于Collagen/PBS组,Collagen/ovCYR61 En-PSCs组与Collagen/En-PSCs组相比无统计学差异。术后90d:Collagen/ovCYR61 En-PSCs组的子宫内膜厚度显著高于Collagen/En-PSCs组及Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组与Collagen/PBS组无统计学差异;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组子宫再生部位的α-SMA阳性面积百分比显著高于Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组显著高于Collagen/PBS组,Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组与Collagen/En-PSCs组无统计学差异;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组子宫再生部位的血管密度显著高于Collagen/En-PSCs组及Collagen/PBS组,Collagen/En-PSCs组与Collagen/PBS组无统计学差异。妊娠实验结果表明,各组大鼠子宫的妊娠率分别是:sham组,100%;Collagen/PBS组,40%;Collagen/En-PSCs,80%;Collagen/si-CYR61 En-PSCs组,12.5%;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组,80%;各组大鼠子宫再生区域的妊娠率分别是:Collagen/PBS组,0;Collagen/En-PSCs组,20%;Collagen/si-CYR61 En-PSCs组,12.5%;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs组,40%。结论:本研究证明CYR61能够促进血管生成。ov-CYR61 En-PSCs能够更好地促进大鼠子宫损伤区域内膜、平滑肌和血管的再生。ov-CYR61 En-PSCs及En-PSCs的移植能够提高大鼠损伤子宫的妊娠率。ov-CYR61 En-PSCs较En-PSCs移植能够增加大鼠子宫受损部位的妊娠率。
【图文】：

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图 1 En-PSCs 的分离、培养、鉴定图 A 示流式细胞术分选 En-PSCs；图 B-L 示流式细胞术分析 En-PSCs 的 MSCs 免疫标记物。2 En-PSCs 具有多向分化能力PDGFRβ，NG2 和 α-SMA 是血管旁细胞的特异标志物分子[14]。培养的第 6 代 En-PSCs 表达 PDGFRβ（图 2A）、NG2（图 2B）和 α-SMA（图 2C），，说明 En-PSCs 是血管旁细胞。通过成脂和成骨诱导分化实验，第 6 代的 En-PSCs 在第 30d 分别经油红 O染色检测到脂肪滴（图 2D）、茜素红 S 染色检测到钙化结节（图 2E）。En-PSCs 经成神经分化实验后，通过免疫荧光染色检测到神经标志物 NSE（图 2F）和 NFM（图2G）。这些结果表明，En-PSCs 具有成脂、成骨和成神经分化潜能。

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图 2 En-PSCs 的鉴定及多向分化潜能图 A-C 细胞免疫荧光示 En-PSCs 中 PDGFRβ、NG2 和 α-SMA 的表达，标尺：25μm；图O 染色示脂肪滴，标尺：50 μm；图 E 茜素红 S 染色示钙化结节，标尺：50 μm；图 F-光染色示 NSE 和 NFM 的表达，标尺：50 μm。3 En-PSCs 分泌 CYR61 等血管生成相关的多种因子质谱分析显示，En-PSCs 可分泌与血管生成相关的多种因子（表 1）。在上清中，质谱分析共检测出 929 种蛋白质。通过 david 6.8（https://david.ncif进行的 Go 功能注释聚类分析表明，这些识别的蛋白质中含有 203 种分泌蛋出）。通过 Uniprot 在线蛋白库（https://www.uniprot.org/）与已知与血管生成相关的 781 种蛋白进行比较，其中包含 38 种与血管生成相关的蛋白（表 1）即在其中。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714

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