三氧化二砷抑制人卵巢癌细胞中糖皮质激素受体表达的机制及生物学意义

发布时间：2020-05-08 10:30

【摘要】：一、研究背景和目的三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3,ATO)是中药砒霜的主要成分,它作为药物已使用了数千年。大量的体内和体外实验证明,ATO除了能治疗血液系统肿瘤(如APL~([1,2]),多发性骨髓瘤~([3,4])等),对多种恶性实体瘤如肝癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌等也有强大的抗癌作用~([5-10])。目前认为,ATO抗肿瘤作用的机制较为复杂,涉及到诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤转移和抑制血管生成等多个方面。尽管有关ATO抗肿瘤的机制研究有了相当大的进展,但尚未完全阐明,特别是ATO究竟是通过何种靶分子发挥抗肿瘤的效应。糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)是核受体超家族成员之一。GR几乎在所有组织细胞中表达,其介导的糖皮质激素的生物学效应涉及细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等多个方面,与肿瘤的发生发展关系密切。卵巢癌是一种雌激素依赖性的肿瘤,雌激素通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导的信号转导通路在卵巢癌发生、发展中发挥重要的作用。但一个令人感兴趣的现象是,在卵巢癌组织标本中,GR具有高丰度的表达,甚至在没有雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达的卵巢癌细胞中仍有GR的表达,这提示GR可能参与了卵巢癌发生发展的调控。本课题组在前期的研究中发现,ATO能够诱导人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡,并且可明显抑制GR的表达,远远高于对ER的抑制率。本课题拟在前期已有发现的基础上,探讨ATO抑制GR表达的机制,进一步阐明GR的下调在ATO影响卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭中的作用及其机制。二、研究方法我们选用人卵巢癌SKOV3及HO-8910细胞及其他实体瘤-人肝癌HepG2,人肺腺癌A549细胞作为研究对象,采用Real-time PCR及Western blot方法检测ATO对GR mRNA及蛋白表达的影响。采用细胞计数及MTT方法检测细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞凋亡水平及细胞周期的比例。Transwell小室和ibidi划痕小室分别检测细胞垂直和水平迁移的能力。预包被Matrigel胶的Transwell小室(侵袭小室)检测检测细胞的侵袭能力。三、研究结果(一)ATO抑制多种肿瘤细胞中GR mRNA及蛋白的表达1.ATO可以明显抑制卵巢癌SKOV3细胞中GR的表达,且这种抑制效应具有剂量依赖性和时间依赖性。2.ATO抑制肿瘤细胞中GR表达无细胞特异性,在人卵巢癌HO-8910细胞,人肝癌HepG2细胞,人肺腺癌A549细胞中均证实ATO抑制GR mRNA及蛋白的表达。(二)ATO抑制人卵巢癌细胞GR mRNA及蛋白的表达的机制1.ATO可通过DNA的甲基化及促进GR mRNA的降解抑制卵巢癌中GR mRNA的表达。2.ATO能够增强GR蛋白经泛素蛋白酶体途径的降解。3.ATO抑制GR蛋白与P38的激活及活性氧的产生有关,与JNK的激活无关。(三)GR表达的下调促进了ATO对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用1.ATO可明显抑制卵巢癌细胞的增殖并将细胞周期阻滞于G2/M期,过表达GR可逆转此种抑制效应,其机制可能与GR促进细胞周期相关蛋白(cyclin D1,cyclin E1,cdc27)的表达有关。2.ATO能够明显抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭过程,过表达GR能够逆转此效应。四、结论本实验证实ATO能够以时间依赖性和剂量依赖性方式下调GR的表达,且这种抑制作用没有明显的细胞特异性。ATO抑制GRmRNA的表达与DNA甲基化与促进GRmRNA的降解有关,而对GR蛋白表达的抑制作用可能是通过增强其经泛素蛋白酶体途径的降解。P38及活性氧途径参与了ATO对GR蛋白的下调。ATO通过抑制GR的表达抑制多种周期正性蛋白(cyclin D1,cyclin E1,cdc27)进而抑制了卵巢癌细胞的增殖并将细胞周期阻滞于G2/M期;ATO通过抑制GR的表达还可以显著的抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭过程。
【图文】：

卵巢癌,蛋白表达,卵巢癌细胞,细胞

实验结果一、ATO 对卵巢癌细胞中 GR 表达的影响（一）ATO 抑制卵巢癌 SKOV3 细胞中 GR 表达为明确 ATO 对卵巢癌细胞 SKOV3 中 GR 表达的影响，我们首先用不同浓度处理细胞 24h，采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测 GR mRNA 和蛋情况。结果如图 1A、B 所示，不同浓度的 ATO 可明显抑制 GR mRNA 和蛋，2μMATO 即可下调 GR mRNA 和蛋白的表达，10μMATO 处理细胞 24h 后 mRNA 和蛋白表达抑制率分别为 55%（图 1A，P<0.01）、60%（图 1B，P<0.0表明，ATO 抑制 GR mRNA 和蛋白的表达具有剂量依赖性特点。进一步，我了10μMATO处理细胞不同时间后GR mRNA和蛋白的表达情况。结果如图示，ATO 处理细胞后 4h，GR mRNA 即开始下调，至 48h 降至对照组的 42% P<0.05）。GR 蛋白的表达处理后 12 开始下调，，至 48h 降至对照组的 80% P<0.05）。结果表明，ATO 抑制 GR mRNA 和蛋白的表达具有时间依赖性

人肝癌,卵巢癌,蛋白,不同来源

海军军医大学硕士学位论文（二）ATO 抑制不同来源肿瘤细胞中 GR 的表达为探讨 ATO 对 GR 的抑制是否具有细胞特异性，我们用不同浓度的 ATO 处理不同来源的肿瘤细胞 24h，采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测 GR mRNA 和蛋白的表达情况。结果如图 2 所示，ATO 可明显抑制人卵巢癌细胞 HO-8910、人肝癌细胞 HepG2、人肺腺癌细胞 A549 细胞中 GR mRNA 及蛋白的表达，结果表明 ATO对 GR mRNA 及蛋白的抑制作用无明显细胞特异性。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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