FAM134B介导的内质网自噬导致线粒体相关凋亡在PE发病中的作用机制研究

发布时间：2020-05-10 23:30

【摘要】：目的:子痫前期的发病机制通常与胎盘氧化应激以及凋亡发生有关。本研究旨在明确胎盘组织以及滋养细胞中内质网自噬标记蛋白FAM134B(Family with sequence similarity 134,member B)的表达,并阐明其介导线粒体相关内质网膜中钙离子通道功能障碍导致线粒体相关凋亡在子痫前期(Preeclampsia,PE)发病机制中的作用。方法:收集2017年9月—2017年12月于重庆医科大学附属第一医院产科分娩的8例PE与8例正常剖宫产产妇的胎盘组织。应用蛋白印迹法方法验证FAM134B介导的内质网自噬通过MAMs中的钙离子通道IP3R导致凋亡蛋白Cytochrome C在PE胎盘和正常胎盘中的表达差异;同时通过免疫组织化学法检测胎盘中FAM134B,IP3R的阳性表达;使用早孕人绒毛外滋养细胞株(Human transformed primary extra villous trophoblast cell line,HTR8/SVneo),通过SNP(Sodium nitroprusside)构建PE细胞模型。使用免疫荧光法和激光共聚焦检测细胞FAM134B于内质网中和IP3R在氧化应激状态下的表达;构建FAM134B慢病毒转染细胞。使用蛋白印迹法检测在HTR8/SVneo细胞中沉默和过表达FAM134B后对线粒体相关凋亡的影响;使用流式细胞仪检测正常组,FAM134B敲低组,FAM134B过表达组三组细胞的凋亡百分率。结果:蛋白印迹法结果显示,PE胎盘组织相比于正常胎盘,其内质网自噬蛋白FAM134B,钙离子通道蛋白IP3R和线粒体凋亡蛋白Cytochrome C表达显著增加(p0.05);免疫组织化学结果显示PE组胎盘处内质网自噬和钙离子通道蛋白阳性表达显著增加(p0.001);蛋白印迹法结果显示在SNP诱导的PE细胞模型中FAM134B,IP3R和Cytochrome C蛋白表达显著高于正常HTR8/SVneo细胞(p0.01);蛋白印迹法和流式细胞术显示在HTR8/SVneo细胞中沉默和过表达FAM134B后增加滋养细胞线粒体的凋亡(p0.05)。结论:FAM134B介导的内质网自噬通过线粒体相关内质网膜导致细胞凋亡增加,引起滋养细胞的功能异常,从而参与PE的发生发展。本研究为临床PE的治疗提供了理论基础及潜在的治疗靶点。
【图文】：

白和线粒体相关凋亡的表达首先，我们从临床收集的胎盘制作了石蜡切片，我们使用免疫组化法检测了子痫前期胎盘和正常胎盘中 FAM134B 和 IP3R 的表达水平，进而发现子痫前期胎盘中内质网自噬水平的提高。结果表明，与正常组相比，在子痫前期胎盘 FAM134B和 IP3R 阳性表达增加（图 1A）（p<0.001）。此外，我们使用蛋白印迹法显示FAM134B,IP3R,Cytochrome C 的准确表达水平（图 1B，1C）（p<0.05）。由于FAM134B 是内质网自噬的生物标志物，胎盘组织中我们发现 FAM134B 水平升高，这意味着更多内质网自噬的发生。同时，我们检测到伴随着内质网自噬的增加，MAMs 钙离子通道蛋白 IP3R 及线粒体凋亡蛋白 Cytochrome C 等蛋白水平也可检测到表达增加。同时，免疫组化结果与蛋白印迹趋势相同。这些结果表明，在子痫前期中内质网自噬可能借由 MAMs 的钙离子通道在线粒体中发挥作用。

图 2 在滋养细胞中氧化应激诱导的内质网自噬对 MAMs 钙离子通道以及凋亡表达的影响Figure.2 The effect of calcium ion channel protein, and Mitochondrial associated apoptosis onER-phagy in HTR8/SVneo cells（A）蛋白印迹法表明滋养细胞在 SNP 处理下，IP3R 和 Cytochrome C 通过 FAM134B 影响而显示的蛋白表达。（B）免疫荧光图像分析显示滋养细跑在 SNP 处理组下 FAM134B 的相对表达水平。（C）激光共聚焦图像分析显示滋养细跑在 SNP 处理组下 FAM134B 的相对表达水平。细胞核显示为DAPI标记的蓝色荧光。目标蛋白FAM134B被标记为绿色荧光。ER-Tracker被标记为红色荧光放大图片是ｘ400 和度量尺是 200nM（*p＜0.05，，** p＜0.01）2.3 FAM134B 慢病毒转染使用倒置荧光显微镜检测 FAM134B 慢病毒转染效率，蛋白印迹法验证慢病毒转染后 FAM134B 蛋白表达（图 3）。结果显示，与对照组相比，慢病毒转染后能够在蛋白水平明显抑制 FAM134B 和过表达 FAM134B 的表达，表明转染成功。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.244

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