TWIST2通过miR-221-3p靶向THBS2促进宫颈癌淋巴结转移的分子机制

发布时间：2020-05-14 10:06

【摘要】：研究背景与目的宫颈癌是全球最普遍的女性恶性肿瘤之一,同时也是发展中国家女性最主要的死亡原因。虽然针对人类乳头状病毒的疫苗接种,定期癌症筛查和手术治疗能够降低宫颈癌的发病率,但它仍然是女性最常见的致死病因之一。淋巴结转移是宫颈癌的主要转移途径和影响宫颈癌治疗及预后的独立指标。因此,加强宫颈癌转移机制的基础研究,阐明淋巴结转移的分子机制,对宫颈癌转移进行早期预测、诊断、靶向防治和预后评估是宫颈癌研究的重要内容之一,对于提高宫颈癌治愈率,降低死亡率具有重要科学意义。TWIST2 属于碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix protein,bHLH)家族B类成员。bHLH家族的转录因子调控多种细胞的分化,其中B类成员蛋白易与A类蛋白形成异源二聚体,结合在基因控制区的E-box共有序列(CANNTG),实现对目的基因的转录调控。故而TWIST2可以通过与CANNTG序列结合,从而作为转录因子与下游靶基因的启动子发生作用,发挥转录抑制功能。许多研究表明TWIST2在肿瘤转移过程中发挥了核心作用,其主要通过影响上皮间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)相关蛋白表达从而改变肿瘤细胞的迁移和侵袭能力进而调控肿瘤转移。但是,TWIST2在宫颈癌中的报道较少,并且在肿瘤中对TWIST2所参与的信号通路和分子机制的研究也较少。2014年Wang等的研究发现,TWIST2在宫颈癌中表达上调,且与宫颈癌FIGO分期和淋巴结转移呈正相关。此外,相比于TWIST1,抑制TWIST2其表达后可以显著上调E-Cadherin表达同时下调N-Cadherin表达,进而抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。然而,TWIST2对宫颈癌淋巴结转移的分子调控机制和信号通路,仍有待进一步探索。微小RNA(microRNA,简称miRNA)是一类内源性非编码小RNA,其能结合靶基因3'端转录区域,导致mRNA的降解或者转录后抑制。因此,miRNAs被认为是许多重要生理过程的主要调节因子,包括细胞增殖、分化、发育和凋亡。近年来,大量研究发现人类癌症中存在miRNAs的异常表达,50%以上的人类miRNAs位于肿瘤相关基因区域,例如脆性位点或靠近癌基因。故而,miRNAs的表达失调和多种癌症的进展密切相关。miRNAs可以结合下游靶基因3'端转录区域改变其表达和转录,从而发挥生物学作用。同时,miRNAs还受到上游转录因子的调控。因此,转录因子-miRNAs-靶基因形成完整的调控网络进一步参与肿瘤的发生发展,其中包括宫颈癌。大量实验结果表明,miRNAs因为其稳定性和保守性可作为肿瘤的诊断标记物和治疗靶点。一些文献报道了 TWIST2和部分miRNAs紧密相关。同时,TWIST2作为转录因子可以通过结合miRNAs上游启动子区域从而促进其表达。基于此,我们对过表达TWIST2的Siha细胞进行了 Agilent miRNAs芯片检测。在检测到的36个差异表达超过2倍的miRNAs中,我们采用荧光定量PCR对其中的表达差异明显的miRNA-221-3p进行了验证。结果显示,过表达TWIST2后,miR-221-3p的表达显著上调。同时,通过Jaspar数据库筛选了 miR-221-3p上游启动子区域,发现了 85个潜在调控miR-221-3p且促肿瘤转移的转录因子,其中包括TWIST2。因此,我们推测TWIST2作为转录因子可能通过直接结合miR-221-3p的启动子区域进而促进其转录表达。本文的主要内容是着重探讨了 TWIST2是否通过靶向调控miR-221-3p进而介导了宫颈癌的EMT,促进淋巴结转移。同时探讨了 miR-221-3p进一步调控宫颈癌EMT的具体分子机制。这为我们理解宫颈癌发生EMT进而转移提供了一定的理论基础,也为寻找宫颈癌潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。研究内容与方法1.TWIST2调控宫颈癌细胞发生EMT进而促进其淋巴结转移(1)设计并构建稳定过表达TWITS2慢病毒载体并进行宫颈癌细胞转染,运动荧光定量PCR和Western blot检测转染效率。选取稳定过表达TWIST2的宫颈癌细胞进行后续实验。(2)划痕实验和Transwell侵袭实验检测TWIST2对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。(3)乆淋巴结转移模型验证TWIST2对宫颈癌细胞淋巴结转移的影响。(4)荧光定量PCR和Western Blot检测TWIST2对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。2.TWIST2通过调miR-221-3p转录进而促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭(1)miRNAs芯片检测稳定过表达TWIST2后的Siha细胞中表达变化的miRNAs,并用荧光定量PCR验证和寻找差异表达显著的miRNA-221-3p进行后续研究。(2)生物信息学分析TWIST2可以结合miR-221-3p的启动子区域,双荧光素酶报告基因检测TWIST2与miRNA-221-3p启动子的直接结合并能促进其转录。(3)设计并构建miR-221-3p稳定过表达慢病毒载体并运用荧光定量PCR进行验证。(4)划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-221-3p对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。(5)乆淋巴结转移模型验证miR-221-3p对宫颈癌细胞淋巴结转移的影响。(6)荧光定量PCR和WesternBlot检测miR-221-3p对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。(7)划痕实验和Transwell侵袭实验验证TWIST2通过直接调控miR-221-3p进而影响宫颈癌细胞的体外功能。(8)荧光定量PCR和Western Blot检测TWIST2通过调控miR-221-3p进而影响EMT相关蛋白表达。3.miR-221-3p直接靶向调节THBS2进而影响宫颈癌细胞的功能(1)生物信息学预测THBS2可能为miR-221-3p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因验证miR-221-3p可以直接结合THBS2的3'-UTR区域进而抑制其表达。并采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达和沉默miR-221-3p后对THBS2表达的影响。(2)划痕实验和Transwell侵袭实验检测THBS2对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。(3)荧光定量PCR和WesternBlot检测THBS2对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。(4)划痕实验和Transwell侵袭实验验证miR-221-3p通过直接调控THBS2进而影响宫颈癌细胞的体外功能。(5)荧光定量PCR和Western Blot检测miR-221-3p通过直接调控THBS2进而影响EMT相关蛋白表达。4.TWIST2-miR-221-3p-THBS2信号通路在临床组织标本中的表达和分析(1)荧光定量PCR和免疫组化检测TWIST2和THBS2在10例正常宫颈组织、23例不伴淋巴结转移的宫颈癌组织和22例伴淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达水平。(2)荧光定量PCR和原位杂交检测miR-221-3p在10例正常宫颈组织、23例不伴淋巴结转移的宫颈癌组织和22例伴淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达水平。(3)统计分析宫颈癌临床样本中TWIST2、miR-221-3p、THBS2之间的表达相关性。结果1.TWIST2调控宫颈癌细胞发生EMT进而促进其淋巴结转移成功构建稳定过表达TWIST2的Siha(Siha-TW2)和Hela(Hela-TW2)细胞株。随后运用划痕实验和Transwell侵袭实验检测稳定过表达TWIST2后对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭的作用。划痕实验结果表明,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的迁移率明显增高(P=0.005;P=0.003);Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的穿膜细胞数显著增多(P0.001;P=0.003)。采用乆淋巴结转移实验检测稳定过表达TWIST2后对宫颈癌细胞体内淋巴结转移的作用。结果表明,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的乆淋巴结转移率明显增高(33.3%vs.83.3%;16.7%vs.66.7%)。采用荧光定量PCR和Western blot检测稳定过表达TWIST2后宫颈癌细胞EMT相关蛋白的表达变化。结果显示,Siha-TW2和Hela-TW2的N-Cadherin和Vimentin表达上调,E-Cadherin表达下调,而沉默组的结果相反。2.TWIST2 通过上调miR-221-3p转录进而促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭对Siha-TW2进行AgilentmiRNAs芯片检测一共发现了 36个差异表达miRNAs,选取其中表达差异最明显且上调的miR-221-3p采用荧光定量PCR验证。结果显示,过表达TWIST2后,miR-221-3p的表达显著下调(P0.001;P0.001)。进一步利用生物信息学预测,发现TWIST2和miR-221-3p上游启动子序列存在结合靶点,随后利用双荧光素酶报告基因对该结合位点进行验证。结果表明,过表达TWIST2后可以促进其与miR-221-3p启动子的结合,沉默TWIST2后可以抑制其与miR-221-3p启动子的结合(P均小于0.001)。构建稳定过表达miR-221-3p慢病毒载体并转染Siha(Siha-221)和Hela(Hela-221),荧光定量PCR验证表明miR-221-3p在Siha-221和Hela-221中上调超过200倍和120倍(P0.001;P0.001)。随后进行体内/外功能实验。体外迁移和Transwell 侵袭实验结果表明,Siha-221 和 Hela-221 的体外迁移(P=0.003;P=0.001)和侵袭能力(P=0.001;P=0.001)明显增强。体内行乆淋巴结转移实验结果表明,与对照组相比,Siha-221和Hela-221的淋巴结转移率明显增高(37.5%vs.87.5%;25%vs.75%)。采用荧光定量PCR和Western blot检测Siha-221和Hela-221中EMT相关蛋白的表达变化。结果显示,Siha-221和Hela-221的EMT相关蛋白N-Cadherin和Vimentin表达上调,E-Cadherin表达下调。进一步瞬时转染 miR-221-3pinhibitor 至 Siha-TW2(Siha-TW2/221 KN)和Hela-TW2(Hela-TW2/221KN)中,随后采用划痕和Transwell侵袭实验来检测细胞功能的变化。实验结果显示,与Siha-TW2和Hela-TW2相比,Siha-TW2/221 KN 和 Hela-TW2/221 KN 的体外迁移(P=0.004;P=0.005)和侵袭能力(P0.001;P=0.003)明显减弱。该结果提示,miR-221-3p对TWIST2促细胞迁移和侵袭的能力有协同作用。采用荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 Siha-TW2、Siha-TW2/221 KN、Hela-TW2和Hela-TW2/221 KN EMT相关蛋白的表达变化。结果显示,与Siha-TW2和 Hela-TW2 相比,Siha-TW2/221 KN 和 Hela-TW2/221 KN 的 N-Cadherin 和Vimentin表达下调,E-Cadherin表达上调。该结果提示,miR-221-3p对TWIST2促细胞EMT有协同作用。3.miR-221-3p直接靶向调节THBS2进而影响宫颈癌细胞的功能在3个miRNA靶基因预测网站上对miR-221-3p可能的靶基因进行了预测,同时结合miR-221-3p的Westernblot和荧光定量PCR结果,选取了 THBS2这个可能的靶基因。Western blot和荧光定量PCR结果表明,miR-221-3p mimic组中宫颈癌细胞中THBS2表达下调(P均小于0.001),miR-221-3p inhibitor组中宫颈癌细胞中THBS2表达上调(P均小于0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示,在THBS2基因3'-UTR区域中加入miR-221-3p mimic可以抑制载体荧光的表达(P0.001),而突变靶基因3'-UTR区域的荧光强度不发生改变。该结果提示,miR-221-3p可以特异性结合靶基因THBS2的3'-UTR区域,负性调控THBS2的表达。瞬时转染THBS2过表达质粒至Siha(Siha-TH2)和Hela(Hela-TH2)中,随后进行划痕和Transwell侵袭实验。实验结果表明,Siha-TH2和Hela-TH2的体外迁移(P=0.001;P=0.002)和侵袭能力(P=0.001;P=0.003)明显减弱。采用荧光定量PCR和Western blot检测瞬转Siha-TH2和Hela-TH2的EMT相关蛋白表达变化。结果显示,Siha-TH2和Hela-TH2的N-Cadherin和Vimentin表达下调,E-Cadherin表达上调。进一步将THBS2过表达质粒瞬转至Siha-221(Siha-221/TH2)和Hela-221(Hela-221/TH2)。随后采用划痕和Transwell侵袭实验来检测细胞功能的变化。实验结果显示,Siha-221/TH2 和 Hela-221/TH2 可以逆转 Siha-221 和 Hela-221 增强的迁移(P=0.003;P=0.002)和侵袭能力(P0.001;P0.001)。即 miR-221-3p可以通过下调THBS2的表达进而促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。采用荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 Siha-221/TH2 和 Hela-221/TH2 的EMT相关蛋白表达变化。结果显示,Siha-221和Hela-221相比,Siha-221/TH2和 Hela-221/TH2 的 N-Cadherin 和 Vimentin 表达下调,E-Cadherin 表达上调。即miR-221-3p可以通过下调THBS2的表达进而促进宫颈癌细胞发生EMT。4.TWIST2-miR-221-3p-THBS2信号通路在临床组织标本中的表达和分析运用荧光定量PCR、免疫组化和原位杂交检测TWIST2、miR-221-3p和THBS2在10例正常宫颈组织、23例不伴淋巴结转移的宫颈癌组织(I-II期)和22例伴淋巴结转移的宫颈癌组织(I-II期)中的表达水平。结果显示,正常宫颈组织中,TWIST2和miR-221-3p基本不表达。不伴淋巴结转移的宫颈癌组织中,TWIST2、miR-221-3p的表达量中等偏低,而THBS2的表达量中等。伴淋巴结转移的宫颈癌组织中,TWIST2和miR-221-3p表达量高,而THBS2的表达偏低。其中TWIST2的表达主要位于细胞核,而miR-221-3p和THBS2的表达主要位于细胞浆。最后对TWITS2、miR-221-3p和THBS2之间表达相关性进行了分析。结果表明,TWIST2 和 miR-221-3p 之间存在正相关关系(r=0.867,P0.001),miR-221-3p和THBS2之间存在负相关关系(r=-0.729,P0.001)。结论TWIST2作为转录因子可以与miR-221-3p上游启动子区域的位点结合并上调其转录,从而促进miR-221-3p与THBS2的3'-UTR区域靶向结合,下调THBS2的表达,进一步通过上调N-Cadherin和Vimentin的表达,下调E-Cadherin的表达来促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。此外,TWIST2和miR-221-3p在伴淋巴结转移的宫颈癌临床样本中高表达,而THBS2在伴淋巴结转移的宫颈癌临床样本中低表达。同时,TWIST2与miR-221-3p的表达呈正相关,而miR-221-3p与THBS2的表达呈负相关。
【图文】：

过表达,转染,慢病毒,荧光

ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ邋ＴＷＩＳＴ２逡逑进一步采用荧光定量ＰＣＲ（邋ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测Ｓｉｈａ和Ｈｅｌａ转染慢病毒后ＴＷＩＳＴ逡逑ｍＲＮＡ的表达情况。如图１－２和表１－１所示，Ｓｉｈａ－ＴＷ２和Ｈｅｌａ－ＴＷ２的ＴＷＩＳＴ２逡逑ｍＲＮＡ邋表达水平明显高于邋Ｖｅｃｔｏｒ邋组（Ｓｉｈａ－Ｖｅｃｔｏｒ邋ｖｓ．邋Ｓｉｈａ－ＴＷ２：邋１．０５±０．０７邋ｖｓ．逡逑１３２．２８±９．５４，尸＜０．００１；邋Ｈｅｌａ－Ｖｅｃｔｏｒ邋ｖｓ．邋Ｈｅｌａ－ＴＷ２：邋１．０８±０．１１邋ｖｓ．邋７４．１６±１４＿０１，逡逑尸＜０．００１邋）。且运用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验检测Ｓｉｈａ和Ｈｅｌａ转染慢病毒后ＴＷＩＳＴ蛋白逡逑的表达情况。如图１－１Ｃ，Ｓｉｈａ－ＴＷ２和Ｈｅｌａ－ＴＷ２的ＴＷＩＳＴ２蛋白水平同样明显逡逑高于Ｖｅｃｔｏｒ组。这些结果表明，过表达ＴＷＩＳＴ２的Ｓｉｈａ－ＴＷ２和Ｈｅｌａ－ＴＷ２细胞逡逑株己被成功构建，可运用于后续研究。逡逑１９逡逑

过表达,划痕实验,小室,宫颈癌

逦５１．２６±７．２３逡逑我们同时采用了邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室侵袭实验对稳定过表达ＴＷＩＳＴ２的Ｓｉｈａ－ＴＷ２逡逑和Ｈｅｌａ－ＴＷ２的侵袭能力进行了检测。如图１－４和表１－３，，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室侵袭实逡逑验结果显示，与Ｖｅｃｔｏｒ组相比，Ｓｉｈａ－ＴＷ２和Ｈｅｌａ－ＴＷ２的穿膜细胞数明显增多逡逑（Ｓｉｈａ－Ｖｅｃｔｏｒｖｓ．Ｓｉｈａ－ＴＷ２：邋５８．３７±１０．３７邋ｖｓ．邋１６８．６７±１２．３１，邋？＜０．００１；邋Ｈｅｌａ－Ｖｅｃｔｏｒ逡逑ｖｓ．Ｈｅｌａ－ＴＷ２：邋３７．７２±８．４５ｖｓ．９９．１７±１５．３５，邋Ｐ＝０．００３）。这些结果提示，在宫颈癌逡逑细胞中过表达ＴＷＩＳＴ２后
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

【参考文献】