基因修饰小鼠卵巢肿瘤细胞株的建立及ASAP1促进人卵巢癌细胞上皮—间质转型的研究

发布时间：2020-05-17 01:06

【摘要】：目的和意义:卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。卵巢癌的病因复杂,基因因素在其发生、发展过程中具有重要作用,涉及抑癌基因的失活和癌基因的激活。因缺乏合适的卵巢肿瘤模型,卵巢癌发生机制的研究受到限制。p53基因突变与功能丧失是卵巢癌中最常见的基因异常之一。C-Myc基因在卵巢癌中有很高的检出率。实验室前期研究发现ASAP1基因在卵巢癌发生中具有重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9系统对小鼠原代卵巢上皮细胞p53基因进行敲除。同时利用慢病毒载体系统将p53~(-/-)、c-Myc、ASAP1单独或组合转导入原代小鼠卵巢上皮细胞,研究转基因小鼠上皮细胞的生物学特性改变。对具有成瘤潜力的细胞株进行NSG小鼠皮下注射,观察在动物体内成瘤情况。为进一步研究ASAP1基因在人卵巢癌中的作用,将ASAP1过表达载体转导入SKOV3和OVCAR3细胞系,分析其在人卵巢癌细胞系过表达后对细胞功能的影响。本研究建立了一种小鼠卵巢上皮细胞肿瘤细胞株,该细胞株通过修饰原代小鼠卵巢上皮细胞的p53~(-/-)、c-Myc、ASAP1基因获得,这3个基因在人类卵巢癌中异常表达。该模型能够模拟卵巢癌的发生和发展过程,可用于卵巢癌起始和进展的基本生物学研究,鉴别卵巢肿瘤的标志物,研究转移能力和侵袭性等生物行为变化以及卵巢肿瘤不同治疗方法的特定分子通路改变。人卵巢癌细胞系的研究结果显示ASAP1发挥癌基因作用,促进肿瘤转移和化疗药物抵抗,可能成为一个新的治疗靶点。材料与方法:利用CRISPR/Cas9系统构建p53基因敲除载体,lentiviralCRISPRv2-p53。C-Myc基因过表达载体pLenti-Myc、ASAP1基因过表达载体pLenti-ASAP1以及p53基因敲除载体lentiviralCRISPRv2-p53,利用慢病毒载体系统进行包装。将p53~(-/-)、c-Myc以及ASAP1基因单独或组合转导原代小鼠卵巢上皮细胞,分析转基因小鼠上皮细胞的生物学特性改变:Western blot检测蛋白表达情况,MTT法检测转基因细胞生长增殖能力,利用流式细胞计数仪对细胞周期进行检测,软琼脂试验鉴定细胞的锚定非依赖生长能力,用单层培养试验分析转基因细胞的克隆形成能力。根据细胞功能试验结果选择p53~(-/-)+Myc+ASAP1基因组合转导的小鼠卵巢上皮细胞注射入NSG小鼠皮下,观察成瘤情况,并对肿瘤进行初步分析。建立ASAP1过表达人卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞系,对照组为荧光素酶载体。分析细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆形成以及化疗药物抵抗。结果:(1)p53基因敲除的小鼠卵巢上皮细胞p53蛋白表达显著下降,ASAP1、c-Myc转基因小鼠卵巢上皮细胞ASAP1、c-Myc蛋白表达明显升高,并能在子代细胞稳定遗传。(2)细胞增殖试验结果显示,p53基因敲除细胞增殖快于对照组(P0.05);p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1组细胞增殖高于对照组(P0.05),而且第4天时p53~(-/-)+ASAP1组高于p53组(P0.05);ASAP1、c-Myc组细胞增殖与对照组没有明显差异(P0.05);第4天时,ASAP1+Myc组细胞增殖高于对照组、ASAP1以及c-Myc组(P0.05);从第2天起,p53~(-/-)+Myc+ASAP1组细胞增殖显著快于其他各组(P0.05)。(3)细胞周期检测表明,p53~(-/-)、p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1、Myc以及ASAP1细胞株G1期细胞比例显著低于对照组(P0.05);p53~(-/-)+Myc、Myc以及ASAP1细胞株S期细胞比例显著高于对照组(P0.05);p53~(-/-)+Myc+ASAP1组G1期细胞比例显著低于其他各组(P0.05),S期细胞比例显著高于其他各组(P0.05)。(4)软琼脂试验发现,p53组细胞集落数量多于对照组(P0.05);p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1、ASAP1、c-Myc以及ASAP1+Myc组细胞均不能形成细胞集落;p53~(-/-)+Myc+ASAP1组细胞集落数量显著多于其他各组(P0.05)。(5)单层培养克隆形成试验表明,p53组细胞克隆多于对照组(P0.05);而p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1细胞克隆少于对照组、p53组(P0.05);ASAP1、c-Myc组细胞克隆多于对照组(P0.05);ASAP1+Myc组细胞克隆多于对照组和ASAP1组(P0.05),但与c-Myc组没有差异(P0.05);p53~(-/-)+Myc+ASAP1组细胞克隆显著多于其他各组(P0.05)。(6)异体移植瘤试验显示,p53~(-/-)+Myc+ASAP1细胞在NSG小鼠皮下能形成肿瘤,肿瘤组织以及肿瘤组织中分离的肿瘤细胞可检测到p53蛋白表达降低,ASAP1和c-Myc蛋白过表达。(7)人卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3过表达ASAP1,导致细胞迁移、侵袭能力能力显著高于对照组(P0.0001),细胞克隆形成能力和增殖明显强于对照组(P0.05);上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达明显低于对照组(P0.05)而间质细胞标志性蛋白N-cadherin和vimentin表达显著高于对照组(P0.05);对紫杉醇诱导细胞凋亡的敏感性低于对照组(P0.05)。结论:(1)小鼠卵巢上皮细胞敲除抑癌基因p53导致细胞周期紊乱,细胞增殖加快,克隆形成能力增强;在p53敲除背景下,c-Myc基因过表达对细胞功能没有促进作用,而ASAP1基因过表达促进细胞增殖和细胞周期紊乱,但没有改变细胞的接触抑制效应。(2)小鼠卵巢上皮细胞过表达c-Myc或ASAP1基因引起DNA合成前期细胞减少、合成期细胞增加,单层培养克隆形成能力增强,但对细胞增殖和细胞转化没有影响;而c-Myc基因和ASAP1基因同时过表达对细胞功能没有累积促进作用。(3)敲除抑癌基因p53,同时过表达c-Myc和ASAP1基因,导致原代小鼠卵巢上皮细胞发生了转化,具有了肿瘤细胞的特征:细胞周期紊乱,细胞增殖迅速,接触抑制效应丧失,能在悬浮状态下成簇生长。p53~(-/-)+Myc+ASAP1基因修饰小鼠卵巢上皮细胞能够在NSG小鼠皮下形成肿瘤。(4)ASAP1基因在卵巢肿瘤发生中发挥“驱动基因”作用,其过表达促进人卵巢癌细胞增殖、存活、上皮-间质转型,抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。
【图文】：

结构图,结构图,慢病毒

效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucle更简单高效，使用范围更广，极大缩短了动物模型制究基因因素在卵巢癌发生、发展中的作用，，我们利用 C的 p53 基因进行敲除，用慢病毒系统将 p53-/-、ASAP1原代小鼠卵巢上皮细胞，研究转基因小鼠上皮细胞的细胞的生长增殖能力、细胞周期各时相分布、单层培养集落形成能力进行测定。筛选出具有成瘤潜力的细胞株在动物体内成瘤情况。1.1 LentiCRISPRv2-p53表达质粒的构建及鉴定菌株RISPRv2 载体购自 ZhangLab，该载体具有 Ampicilin核标记，并含有慢病毒包装元件。结构如下：

质粒,无模,鉴定结果,琼脂糖凝胶电泳

图 2 LentiviralCRISPRv2质粒 BsmBI 酶切Fig. 2 LentiviralCRISPRv2 plasmid digested by B注：M，marker；1，酶切质粒；2，未酶切质Note: M，marker；1，digested plasmid；2，undiges质粒 lentiviralCRISPRv2-p53 PCR鉴定结果1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见 200bp 左右扩增产物 3。图 3 重组质粒 lentiviralCRISPRv2-p53 PCFig. 3 reconstructured plsamid lentiviralCRISPRv2-注：M，marker；1、3，无模板对照；2、4，p53te: M，marker；1、3，template free contronl；2、4，p5
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】