Chemerin与妊娠期糖尿病的相关研究

发布时间：2020-05-17 20:37

【摘要】：妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次发生或发现的糖尿病,妊娠期糖尿病在全世界尤其是在发展中国家的发病率正在逐年上升。GDM是威胁孕妇、胎儿健康的常见妊娠期并发症之一,可导致孕妇能量代谢功能紊乱,从而发生巨大儿、羊水过多、自然流产、胎儿畸形、胎儿窘迫、死胎、死产、新生儿低血糖、新生儿低钙血症及高胆红素血症等,对母婴危害较大。其发病机制至今尚不清楚,目前较一致的观点为：GDM与2型糖尿病(T2DM)有着相似的发病基础,即遗传基因缺陷基础上存在胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和胰岛素分泌功能相对不足,其中IR占主要位置。脂肪组织是人体最重要的内分泌器官之一,合成和分泌多种脂肪因子,包括瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α、白细胞介素6(interleukin6, IL-6)和新发现的抵抗素(resistin)、内酯素(visfatin)、apelin、脂类快速趋化因子(fasting-induced adipose factor, FIAF)、视黄醇结合蛋白4(retinol-binding protein4, RBP4)及趋化素(chemerin):等。Chemerin在人体的脂肪组织、肾上腺、肝脏、肺、胰腺、胎盘、卵巢、皮肤等都有表达,其中主要表达于白色脂肪组织、肝脏和肺,参与炎症反应、调节糖脂代谢等。其表达水平与肥胖相关,并有调节脂肪细胞的分化、脂解,促进脂肪细胞内胰岛素信号传导途径等生物学效应。作为新近被认识的脂肪因子Chemerin在肥胖、胰岛素拮抗、代谢综合征和2型糖尿病的发生、发展中所起的作用引起了越来越多的关注和越来越深入的研究。但正因为其新近被发现而且存在着人种等差异,目前对于它的认识还很不全面,许多问题尚待阐明。如Chemerin基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的分布及与脂肪组织中Chemerin mRNA转录与蛋白水平的表达和血浆浓度之间存在的内在关联程度；以及与肥胖、胰岛素拮抗和糖代谢异常病变程度上的相关性均未被揭示。妊娠期糖尿病往往结合了肥胖、胰岛素拮抗和糖代谢异常,但是Chemerin与妊娠期糖尿病的相关研究极少。本研究拟从整体水平探讨妊娠期糖尿病外周血和脐带血Chemerin的变化以及与代谢指标的关系；从细胞水平和分子水平探讨妊娠期糖尿病的脂肪细胞和胎盘组织Chemerin mRNA和蛋白表达；同时采用基因扩增后直接测序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的变化和分布；进一步阐明Chemerin SNPs与妊娠期糖尿病临床指标的关系。从而深入研究妊娠期糖尿病的发病机制,为筛选有价值的疾病标志物及治疗靶点提供依据,完善妊娠期糖尿病的预测和诊断方法,以期为改善妊娠期糖尿病围产结局提供新途径。第一部分妊娠期糖尿病患者Chemerin的变化及其临床意义研究目的：分别测定GDM组和正常对照组孕妇外周血和脐血Chemerin的变化及其与BMI、血糖、血脂等指标的相关性,探讨Chemerin与GDM的关系。方法：选取2012年1月到2012年10月在浙江大学医学院附属妇产科医院产科门诊定期产检并住院待产的孕妇,参照2011年ADA诊断标准于孕24～28周诊断为GDM46例为GDM组,同期选取年龄、孕周、孕前体重指数等指标与GDM组相匹配的孕妇43例作为正常对照组,所有入选病例均于37-40周分娩。入院后由专人详细记录孕妇年龄、身高、孕前体重以及孕期体重增加量；同时分别测定两组分娩前空腹血糖(Fast Plasm Glucose, FPG)、空腹胰岛素(Fast Insulins,Fins)、糖化血红蛋白(HemoglobinAlc, HbAlc)、总胆固醇(Total Cholesterole,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、孕前BMI、分娩时BMI。新生儿娩出断脐后,立即用一次性无菌注射器从脐带胎盘端抽取静脉脐血l0ml。用酶联免疫吸附(ELISA)法测定外周血及脐血Chemerin值；同时测量新生儿的体重(kg)和身长(Ht),计算BMI。结果： 1.临床资料比较：两组孕妇的年龄、孕周、产次、孕次、孕前BMI差异无统计学意义(P均0.05)。GDM组孕期体重增加及分娩时BMI明显高于正常对照组(P均0.05)。 2.两组血糖、血脂、炎症指标、胰岛素和Chemerin的比较：GDM组外周血Chemerin水平显著高于正常对照组(P0.05)；同时,FPG、Fins、TG、HbAlc及HOMA-IR、CRP、WBC均高于正常对照组(P均0.05)；而两组的TC、HDL、LDL水平差异无统计学意义(P0.05)。 3.外周血Chemerin与各项指标的相关性分析：正常对照组Chemerin与FPG和HOMA-IR以及TG均负相关(r分别为-0.582,-0.376,-0.427,P分别为0.000,0.016,0.008)；而GDM组Chemerin与上述指标之间无相关性,但是与孕期体重增加量和分娩时BMI呈正相关(r分别为0.336、0.340,P分别为0.026,0.022)。 4.两组脐带血Chemerin水平和新生儿体质量比较：GDM组脐带血Chemerin水平显著高于对照组,分别为22.50±4.36pg/ml和19.85±6.06pg/ml,差异有显著性(P0.05)；GDM组新生儿体重、BMI分别与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P均0.05)。 5.两组外周血和脐血中Chemerin水平的比较：GDM组外周血、脐血Chemerin水平均显著高于正常对照组相应测定值(P分别为0.001、0.026)；GDM组和正常对照组的脐血Chemerin水平显著高于同组外周血中的水平(P分别为0.005、0.029)。结论： (1)正常对照组外周血Chemerin水平与血糖、血脂代谢指标相关,提示Chemerin参与正常妊娠期能量代谢调节,保持妊娠期血糖、血脂水平稳定。 (2)GDM组外周血Chemerin水平明显高于正常对照组,而且与孕期体重增加和分娩时BMI相关,但是与代谢指标无相关性。提示GDM组孕期体重增加过多导致Chemerin功能失衡,可能与GDM能量代谢异常有关。 (3)GDM组新生儿出生体重和脐带血Chemerin水平均较正常对照组明显增加,推断Chemerin与GDM子代的并发症有关。第二部分妊娠期糖尿病患者脂肪和胎盘Chemerin mRNA以及蛋白表达的变化研究目的：分别检测GDM组和正常对照组脂肪和胎盘组织中Chemerin mRNA以及蛋白表达的变化,探讨Chemerin在妊娠期脂肪和胎盘组织中的分布情况以及与GDM的关系。方法：选取2012年1月到2012年10月在浙江大学医学院附属妇产科医院产科门诊定期产检并住院待产的孕妇,参照2011年ADA诊断标准于孕24～28周诊断为GDM46例为GDM组,同期选取年龄、孕周、孕前体重指数等指标与实验组相匹配的孕妇43例为正常对照组,所有入选病例均于37-40周分娩。择期剖腹产手术时采集产妇下腹部皮下脂肪约5g；胎盘娩出后留取脐带根部胎盘组织lcm x lcm x lcm,所有组织均液氮保存。通过荧光定量PCR检测GDM组和正常对照组脂肪及胎盘组织中Chemerin mRNA表达；通过Westernblot检测两组脂肪和胎盘组织中Chemerin蛋白表达。结果： 1.总RNA提取的质量检测：通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。紫外灯下可见28s,18s,5s三条rRNA的条带清晰,28s条带的强度高于18s将近2倍,18s条带的强度又高于5s,表明RNA质量良好。 2.实时荧光定量PCR扩增(SYBRGreenI荧光定量PCR相对定量法)。 2.1扩增曲线：通过PCR仪自动生成的扩增曲线可以看到目的基因Chemerin以及内参基因Actin扩增曲线的线条圆滑,跨度大体一致,提示基因的扩增表达情况良好。 2.2两组脂肪和胎盘组织Chemerin mRNA表达比较： GDM组脂肪组织和胎盘组织Chemerin mRNA平均表达量均高于正常对照组。差异具有显著性(P0.01)。 3.两组脂肪和胎盘组织Chemerin蛋白表达比较：经过灰度分析统计,GDM组脂肪和胎盘Chemerin/GAPDH均值均明显高于正常对照组,差异具有显著性(P0.01)。结论： (1) Chemerin在妊娠期脂肪和胎盘组织中均有表达,参与正常妊娠生理代谢过程。 (2)GDM组脂肪组织和胎盘Chemerin mRNA和蛋白表达量均高于正常对照组,提示脂肪源性和胎盘源性的Chemerin参与GDM的发生发展。第三部分妊娠期糖尿病患者Chemerin基因的单核苷酸多态性分析研究目的采用基因扩增后直接测序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的变化和分布；进一步阐明Chemerin SNPs与妊娠期糖尿病临床指标的关系。方法：选取2012年1月到2013年10月在浙江大学医学院附属妇产科医院产科门诊定期产检并住院分娩的孕妇,参照2011年ADA诊断标准于孕24～28周诊断为GDM330例为实验组；同期选取年龄、孕周、孕前体重指数等指标与实验组相匹配的孕妇329例作为正常对照组,所有入选病例均于37-40周在本院分娩。各受试者进行空腹血糖、甘油三酯等生化指标的检测。基于文献、NCBI及生物信息学软件,筛查到rs3735170、rs6970196、rs10244748、rs17173608、rs1804764、rs3210475、 rs10278590(rs4721)、rs3735168、rs9942696、rs17835937十个位点。提取所有受试者基因组DNA,用直接测序法分析上述位点基因型,并进行相关分析。结果 1.研究对象的临床特征：两组实验对象的年龄、孕周、孕前BMI、SBP、DBP、 TC、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、ALT、GOT均没有显著性差异(P均0.05)；两组FPG、TG、WBC、CRP、HOMA-IR、Fins均有显著性差异(P均0.05)。 2.测序：各SNP位点测序结果均与探针法分型结果完全一致。 3.基因型和等位基因频率分析 3.1HWE检验：经Hardy-Weinberg检验分析,7个位点的P值均远远大于界值0.05,所研究的7个SNPs位点上观察值与期望值相吻合,各基因频率达到遗传平衡,研究资料具有群体代表性,证明它们符合Hardy-Weinberg平衡。 3.2各SNP位点病例对照研究 rs3735170位点的C等位基因频率在孕妇GDM病例组中为13.5%,正常对照组中为33.4%,C等位基因为GDM的保护因素(P=0.038),OR为0.303(0.103-0.886)；T等位基因频率在GDM组为86.5%,正常对照组为66.6%,携带C的基因型CC+CT vsTT在GDM组中的分布频率亦降低,P值为0.027,达到统计学意义。 rs17173608的C等位基因频率在GDM组为1.7%,正常对照组为13.3%,C等位基因为GDM的保护因素(P=0.039),OR为0.132(0.015-1.177)；A等位基因频率在GDM组为98.3%,在正常对照组为86.7%,携带C的基因型CC+CA vs AA在GDM组中的分布频率亦降低,P值为0.039,达到统计学意义。 rs9942696的T等位基因频率在GDM组为25.2%,正常对照组为16.3%,T等位基因为GDM的高危因素,OR为3.354(1.062-10.590)；C等位基因频率在GDM组为74.8%,在正常对照组为83.7%,携带T的基因型TT+TC vs CC在GDM组中的分布频率升高,P值为0.035,达到统计学意义。其余SNP位点的等位基因及携带的相关基因型在两组间未见统计学差异。 3.3LD检验：没有位点在同一个LD block内,未发现有与GDM发生相关的单倍体型。 4.各基因型间临床及生化指标比较：rs17173608和rs9942696位点各基因型之间未见有统计学差异指标；rs3735170位点在孕期体重增加、FPG、TC、LDL指标中存在基因型组间显著性差异。结论 Chemerin rs3735170(TC)的不同基因型与GDM的发生存在着一定的联系。
【图文】：

顺序图,顺序,脂肪细胞分化,受体

糖尿病中的作用受到国内外学者的广泛关注，但是具体作用机制还不清楚。根据脂肪细胞因子发现顺序（如图1 ) , Chemerin是最近发现的脂肪细胞因子。2007年Bozaoglu_等用信号序列捕获技术首次确定Chemerin是一种脂肪细胞因子，由Chemerin基因（CHEMERIN基因）编码，其编码基因全长3289bp,位于染色体7q36.1,由6个外显子和5个内含子组成。Chemerin有3种受体：Chemerin样受体1(CMKLR 1)、肥大细胞表面趋化因子受体2(CCRL2)以及GPcRs家族成员GPRl[i'IChemerin主要通过自分泌或旁分泌途径作用于CMKLR1受体而实现其生物学功能，如参与炎症反应、调节糖脂代谢等。其表达水平与肥胖相关，并有调节脂肪细胞的分化、脂解，促进脂肪细胞内姨岛素信号传导途径等生物学效应。IL-6 LEPTIN PAM AGT ZAG OmentinPTq jg PJ JUT]r^——— —1992 1993 1994 1^5 ia?7 1C?$ 咖 1 2034 2005 2C06 ￡007T7'0F-ct Adipc'rieclin SAA Chemerin【iT?9 (4) jeiR&P4c,iijV-eis pin p.kpjVlsfatin图1脂肪细胞因子发现顺序Chemerin具有促进脂肪细胞分化功能。Goralski等[丨2]，11011等[】3]，Takahashi等[14】研究报遒，人前脂肪细胞和成纤维细胞(3T3-L1)向脂肪细胞分化的过程中

临床资料,外周血,血脂,血糖

图2 GDM与正常对照组临床资料的比较（f±s)组血糖、血脂、炎症指标、胰岛素、外周血ChemerinDM组外周血Chemerin水平显著高于正常对照组（分别为20.11±363±3.63pg/ml, P=0.001 )；同时，FPG、Fins、TG、HbAlc 及 HOWBC 均高于正常对照组（分别为 6.07±1.74mmol/L, 13.50±2..33mmol/L, 6.10±1.90%, 3.40±1.51，5.04士1.96mg/L, 8.71±1.87 ( x.91mmol/L, 11.63±4.31 mu/L, 3.19±0.96mmol/L, 5.20士0.90%，2.1.17mg/L，，7.85±1.55 ( xlO^/L )，P 均<0.05 );而两组间 TC、HDL、无统计学意义（P均>0.05),见表2,图3，表3，图4。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.256

【参考文献】