HMGA1对宫颈癌增殖和淋巴结转移的作用及相关机制研究

发布时间：2020-05-20 14:00

【摘要】：目的:肿瘤的生长主要是由于肿瘤细胞的恶性增殖所致,而细胞的恶性增殖的主要原因之一是细胞周期异常调节。有报道指出High mobility group AT-hook 1(HMGA1)在多种癌症中均参与细胞的增殖,但其在宫颈癌中的相关研究较少。本研究旨在探讨HMGA1对宫颈癌细胞周期、细胞增殖和肿瘤生长的影响及其相应机制。方法:Oncomine数据库分析HMGA1在宫颈鳞状上皮和宫颈鳞状细胞癌中的表达。收集经病理科医生诊断为宫颈癌患者的癌组织和癌旁组织,以及因妇科良性疾病切除的正常宫颈组织。Real-time-PCR检测目的基因m RNA表达水平。蛋白质免疫印迹和免疫组织化学检测目的基因蛋白表达水平。构建过表达HMGA1的慢病毒和沉默HMGA1的sh RNA慢病毒,感染宫颈癌细胞系,并进行细胞株的稳定筛选。流氏细胞学技术检测不同处理因素干预细胞后各期细胞在细胞周期中所占的比例。采用Cell Counting kit-8和克隆形成实验来分析宫颈癌细胞体外增殖活性。Nude mice体内成瘤实验检测不同处理对宫颈癌细胞成瘤能力和瘤体生长速度的影响。结果:Oncomine数据显示:在宫颈鳞状细胞癌组织中,HMGA1的表达明显高于宫颈鳞状上皮组织中的表达。16位配对的宫颈癌患者标本中检测HMGA1 m RNA表达水平,结果显示:癌组织中的表达明显高于癌旁组织的表达。8位配对宫颈癌患者标本中检测HMGA1蛋白表达水平,结果与m RNA检测的结果相似。免疫组化检测HMGA1蛋白在宫颈癌癌组织和癌旁组织中表达情况,结果提示HMGA1在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,而且HMGA1的表达强度与宫颈癌淋巴结转移和FIGO分级相关,但与患者的年龄、组织学分级、肌层浸润深度、脉管浸润以及组织学分级无关。相关机制探讨发现,过表达HMGA1可以加快细胞周期过程中G1期向S期转化,促进该过程中关键蛋白的表达,增强宫颈癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,从而促进宫颈癌细胞肿瘤的生长。反之,沉默HMGA1表达则可以减缓细胞周期G1期向S期转化,降低相关蛋白的表达量,抑制肿瘤细胞的增殖能力和克隆形成能力,从而减缓肿瘤的生长速度。结论:HMGA1在宫颈癌细胞周期调控过程中可能起着关键作用。这些发现表明HMGA1的高表达可能通过加速细胞周期进展,从而促进宫颈癌的发生发展。这也提示我们:将来HMGA1可能被作为宫颈癌治疗的潜在作用靶点。目的:癌细胞远处转移和播散是影响癌症病人预后的关键因素之一。而肿瘤细胞发生向周围组织的局部浸润侵袭以及经过脉管系统向远处器官播散是癌症转移的必经途径。大量研究报道,High mobility group AT-hook 1(HMGA1)影响癌细胞的侵袭和转移。本研究旨在探讨HMGA1对宫颈癌细胞迁移、侵袭和淋巴结转移的作用及其相应机制。方法:收集经华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科医生诊断为宫颈癌的患者的癌组织,以及因妇科其它良性疾病而行全子宫切除术患者的正常宫颈组织。使用传统方法提取组织和细胞中的总RNA,real-time PCR方法检测目的基因m RNA表达。免疫组化探讨HMGA1在宫颈癌淋巴结转移阳性和淋巴结转移阴性的原发灶组织中的表达差异。构建过表达HMGA1的慢病毒和沉默HMGA1的sh RNA慢病毒,感染宫颈癌细胞系,并进行细胞株的稳定筛选。划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验检测HMGA1对宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的影响。利用ALGGEN PROMO网站预测结构性转录因子HMGA1在其下游靶基因启动子上的结合位点,并构建包含结合位点的启动子报告质粒;利用miRWalk2.0网站上预测miR-221和miR-222在TIMP3的3’UTR区的结合位点,并分别构建包含野生型结合位点和突变型结合位点的3’UTR报告载体。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术方法探究HMGA1对下游靶基因启动子的结合作用。使用裸鼠爪垫淋巴结转移模型探讨HMGA1对宫颈癌淋巴结转移的影响。结果:无论是HMGA1 m RNA还是蛋白表达,它们在宫颈癌淋巴结转移阳性的原发灶组织中的表达明显高于淋巴结转移阴性的原发灶组织中的表达。在宫颈癌组织中,miR-221和miR-222的表达均显著高于正常宫颈,并且它们的表达水平均与HMGA1m RNA水平呈正相关。在体外,HMGA1促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。HMGA1可以调控miR-221/222基因簇的表达,其作用方式是直接结合在miR-221/222基因簇共同的启动子上,进而增强其启动子的活性,促进这两个miRNAs的转录。miR-221和miR-222同样可以促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭,而且它们在一定程度上可以逆转HMGA1体外促进宫颈癌细胞迁移和侵袭的生物学效应。TIMP3是miR-221/222基因簇共同的下游作用靶基因,miR-221/222基因簇可以影响TIMP3、MMP2和MMP9蛋白水平的表达。HMGA1同时也可以调节TIMP3、MMP2和MMP9蛋白水平的表达。裸鼠爪垫淋巴结转移模型结果表明,HMGA1可以加速宫颈癌细胞的淋巴结转移。结论:HMGA1可能在宫颈癌的淋巴结转移过程中发挥着重要作用。HMGA1可能是通过HMGA1-miR-221/222-TIMP3-MMP2/MMP9信号通路参与宫颈癌的淋巴结转移。这提示我们HMGA1可以作为预测宫颈癌淋巴结转移的指标。
【图文】：

宫颈鳞状细胞癌,鳞状上皮,宫颈,数据库

1.1：来自 Oncomine 中的两个数据库（Zhai cervix 和 Scotto cervix）中人宫颈鳞状癌和人宫颈鳞状上皮中 HMGA1 mRNA 的表达。A 图显示在 Zhai cervix 数据库例宫颈鳞状上皮和 21 例宫颈鳞状细胞癌中 HMGA1 mRNA 的表达差异统计。在 Scotto cervix 数据库中，24 例宫颈鳞状上皮和 32 例宫颈鳞状细胞癌中 HMGNA 的表达差异。其中纵坐标是 mRNA 值取 log2 的中位数；CSE 是 Cervicaluamous epithelium 的缩写，表示宫颈鳞状上皮；CSCC 是 Cervical Squamous Cercinoma 的缩写，表示宫颈鳞状细胞癌。上述两个数据库中 HMGA1 mRNA 表达用 T 检验的方法进行统计分析。*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.0

宫颈癌,癌组织,内参,检验方法

图 1.2:HMGA1 在宫颈癌原发灶组织和配对癌旁正常组织中的表达。A 图显示的是HMGA1 mRNA 在 16 位宫颈癌病人癌组织和癌旁正常组织中的表达，以癌旁正常组织为对照，以 GAPDH 为内参基因，使用 2-ΔΔCT方法计算 HMGA1 mRNA 相对表达量并使用配对样本 T 检验方法对癌组织和癌旁正常组织中 HMGA1 表达进行差异分析B 图是 8 位宫颈癌病人的原发灶组织和癌旁正常组织中的 HMGA1 蛋白表达，以GPADH 为内参基因。C 图是对 B 图定量统计的 bar 图，以 GPADH 为内参蛋白，，用配对样本 T 检验方法对癌组织和癌旁组织中 HMGA1 蛋白表达差异进行分析。D 图示的是 HMGA1 蛋白分别在宫颈鳞状细胞癌组织、宫颈腺癌组织、以及配对的癌旁常组织中免疫组织化学染色的典型图片，共 92 例宫颈癌组织和其中 58 个配对的癌正常组织，图片上的比例尺表示 50 微米。E 图显示的是使用 IPP6.0 对 HMGA1 的表达量进行定量，平均光密度 MD（mean density）＜0.35 表示 HMGA1 低表达，平均密度 MD（mean density）＞0.35 表示 HMGA1 高表达，卡方检验用于统计分析 HMGA在癌组织和癌旁组织中的表达差异。CC 是 Cervical Carcinoma 的缩写，PC 是
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

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