人胎盘间充质干细胞诱导为胰岛样细胞对妊娠期糖尿病大鼠的干预实验研究

发布时间：2020-05-21 10:15

【摘要】：目的本研究把人胎盘来源间充质干细胞(hPDMSCs)体外诱导分化为胰岛样细胞(ILC),之后通过尾静脉植入妊娠期糖尿病(GDM)孕鼠体内,通过测定血糖及血清中胰岛素来判断诱生细胞的功能,为人胎盘来源干细胞在GDM患者的临床应用提供基础理论研究依据。此外,本实验还通过检测人胎盘来源干细胞诱导分化为胰岛样细胞的可能性,来探讨人胎盘来源干细胞对妊娠期糖尿病干预作用机制,以期待对GDM、以及产后的Ⅱ型糖尿病的诊断和治疗起到一定指导作用。方法在无菌条件下获取人胎盘组织,从中提取人胎盘源间充质干细胞进行分离、培养。然后利用流式细胞技术进行鉴定,观察分离培养的细胞是否表达CD44和CD105等,以确定分离之细胞是间充质干细胞。将鉴定完毕的干细胞通过含有高糖培养基及低糖培养基将其诱导分化为胰岛样细胞,整个诱导周期约需28天左右。将诱导分化后细胞用双硫腙(DTZ)染色,通过二苯基硫卡巴腙(DTZ)染色确定胰岛细胞的特异性。选取雌性SD大鼠40只,雄性SD大鼠20只。分为正常孕鼠组10只、GDM鼠生理盐水干预组10只、GDM鼠未经干预组10只,GDM鼠ILC干预组10只。GDM组的雌鼠用高脂高糖膳食喂养四周后,将大鼠按雌雄比例2:1比例合笼交配。凡镜下有可见的精子或查到阴栓,即表明已受孕。之后腹腔注射两次STZ(链脲佐菌素),间隔两天。妊娠第4天测空腹血糖,空腹血糖16.7 mmol/L定为GDM鼠模型成立。判定模型成功,即行ILC注射。每次移植后2天及剖宫产术前(妊娠第18天行剖宫产)用血糖仪测量空腹血糖,采用的是Elisa法测胰岛素水平变化。用普通显微镜观察胰岛细胞的形态学变化。结果1.通过流式细胞仪检测,第3代人胎盘间充质干细胞阳性表达CD44、CD105。所得第3代人胎盘间充质干细胞能够用于干细胞干预实验。2.诱导7天后即可看到原本分散的细胞开始聚集成团,随着时间的延长,细胞团的数目和大小均有明显的增加,诱导至28天对诱导后胰岛样细胞采用双硫腙染色法进行鉴定,见团状细胞被染成红棕色,证明该细胞为ILC。3.大鼠造模后,于妊娠第4天测空腹血糖,有30只孕鼠空腹血糖16.7mmol/L,为GDM鼠模型成立,纳入实验分组,分ABCD四组。GDM大鼠ILC干预组10只(A组),GDM大鼠未经干预组10只(B组),GDM大鼠生理盐水干预组10只(C组),正常孕鼠组10只(D组)。4.GDM各组的血糖在6d、12d、18d均高于正常孕鼠组,差异有统计学意义(P0.01)。给予ILC干预GDM组(A组)比B、C组下降更明显,差异有统计学意义(P0.01)。A组在妊娠期间,随着ILC植入次数的增加,空腹血糖进行性下降;A组与B、C组比较在相同时间点血糖水平均降低,组间差异有统计学意义(P0.01);B和C组血糖在孕期无明显变化,组间差异无统计学意义(P0.05)。GDM各组胰岛素在6d、12d、18d均低于正常孕鼠组,差异有统计学意义(P0.01)。未给予ILC干预GDM组(B、C组)比A组下降更明显,差异有统计学意义(P0.01)。A组在妊娠期间,随着ILC植入次数的增加,胰岛素呈逐渐上升状态;A组与B、C组比较在相同时间点胰岛素水平均上升,组间差异有统计学意义(P0.01);B、C组在整个孕期无明显变化,组间差异无统计学意义(P0.05)。5.GDM各组胰岛数目明显减少,体积萎缩,形态不规则,结构松散,外分泌细胞及腺泡被破坏,细胞边界不清,大量淋巴细胞浸润,高倍镜下可见胰岛细胞数量减少。ILC干预组(A组)的受损胰腺组织细胞得到修复,胰腺组织萎缩情况发生逆转,空泡变小,炎性浸润减轻。结论1.该实验成功从人胎盘组织提取获得了胎盘间充质干细胞,通过显微镜在镜下观察其生长及融合情况,证实了其具有间充质干细胞特性,能在体外分离、培养,并表达干细胞表面相关抗体。2.在体外将hPDMSC诱导分化为胰岛样细胞,并利用双硫腙染色法将其染成红棕色,证实诱导的细胞为胰岛样细胞。3.通过尾静脉将胰岛样细胞移植入GDM大鼠体内,血糖仪测量血糖、Elisa法检测移植前后血清胰岛素水平,染色观察胰腺组织形态,诱导细胞干预组孕鼠血糖均有所下降,胰岛素水平回升明显,HE染色诱导细胞干预组胰腺组织明显修复。
【图文】：

实验结果逡逑（一）人胎盘间充质干细胞体外培养形态逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接种４８小时后，，更换培养基液体，贴壁细胞呈长梭形，散在分逡逑布，有的表现为胞浆突起，少部分为多边形。在显微镜下观察第３代人胎盘来源逡逑间充质千细胞，细胞形态表现为均匀的、一致的成纤维细胞样，大多数表现为逡逑单层放射形状、长梭形、平行排列或漩涡状生长。下图为干细胞贴壁生长状态，逡逑生长良好（图１－１，１－２）。逡逑逦

实验结果逡逑（一）人胎盘间充质干细胞体外培养形态逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接种４８小时后，更换培养基液体，贴壁细胞呈长梭形，散在分逡逑布，有的表现为胞浆突起，少部分为多边形。在显微镜下观察第３代人胎盘来源逡逑间充质千细胞，细胞形态表现为均匀的、一致的成纤维细胞样，大多数表现为逡逑单层放射形状、长梭形、平行排列或漩涡状生长。下图为干细胞贴壁生长状态，逡逑生长良好（图１－１，１－２）。逡逑逦
【学位授予单位】：沈阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.256

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本文编号：2674121