microRNA-210调节Notch1表达介导绒毛外滋养细胞生物学行为的机制研究

发布时间：2020-05-26 12:31

【摘要】：第一部分miR-210对EVT的生物学功能的调节的作用目的通过调节miR-210在人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞中的表达,观察其对滋养细胞增殖,迁移,侵袭,凋亡及小管形成能力的影响,探讨miR-210对EVT的生物学功能的影响。方法1、采用原位杂交技术对miR-210在早孕期绒毛组织及母体蜕膜组织的表达进行定位;2、在HTR-8/SVneo细胞中转染miR-210 mimic以增强miR-210的表达,同时转染miR-210 mimic NC作为阴性对照,qRT-PCR检测两组细胞的miR-210的表达;3、在HTR-8/SVneo细胞中转染miR-210 inhibitor以减弱miR-210的表达,同时转染miR-210 inhibitor NC作为阴性对照,qRT-PCR检测两组细胞的miR-210的表达;4、CCK-8法测定转染后HTR-8/SVneo细胞的增殖能力;5、流式细胞术检测转染后HTR-8/SVneo细胞的凋亡能力;6、Transwell实验检测转染后HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力;7、小管形成实验检测转染后HTR-8/SVneo细胞的小管形成能力;8、qRT-PCR和Western Blot分别从RNA和蛋白水平检测两组细胞MMP2、Bcl-2、BAX、VEGF-A、PIGF的表达。结果1、miR-210在绒毛滋养细胞和蜕膜EVT中均有表达,且蜕膜EVT中miR-210的表达水平低于绒毛滋养细胞。2、与miR-210 mimic NC相比,miR-210 mimic组miR-210的表达水平明显升高;且细胞的增殖,迁移,侵袭,小管形成能力均减弱,而细胞的凋亡能力增强;同时MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表达水平均下降,BAX在m RNA及蛋白表达水平均升高,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表达均下降;3、与miR-210 inhibitor NC相比,miR-210 inhibitor组miR-210的表达水平明显下降;且细胞的增殖,迁移,侵袭,小管形成能力均增强,而细胞的凋亡能力减弱;同时MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表达水平均升高,BAX在m RNA及蛋白表达水平均下降,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表达均升高;结论调节miR-210的表达可改变HTR-8/SVneo细胞的增殖,迁移,侵袭,凋亡及小管形成能力,表明miR-210对EVT的生物学功能具有调控作用。第二部分miR-210调控Notch1的表达介导滋养细胞迁移与侵袭功能目的探讨miR-210调控NOTCH1介导的绒毛外滋养细胞生物学功能的作用及其分子机制。方法1、qRT-PCR和Western Blot分别从RNA和蛋白水平检测子痫前期患者胎盘组织与同期正常孕妇的胎盘组织中的NOTCH1的表达;同时检测其中miR-210的m RNA表达水平;2、采用IHC法对早孕绒毛组织及蜕膜进行NOTCH1的表达定位;3、实验分组sh-NOTCH1:转染NOTCH1沉默质粒至HTR-8/SVneo细胞,对应的阴性对照组为scramble sh RNA(sh-Scb);miR-210 mimic:转染miR-210 mimic至HTR-8/SVneo细胞,对应的阴性对照组为miR-210 mimic NC;miR-210 inhibitor:转染miR-210 inhibitor至HTR-8/SVneo细胞,对应的阴性对照组为miR-210 inhibitor NC;miR-210 inhibitor NC+sh-NOTCH1:将miR-210敲低阴性对照组与NOTCH1沉默质粒共转染HTR-8/SVneo细胞;miR-210 inhibitor+sh-NOTCH1:将miR-210敲低组与NOTCH1沉默质粒共转染HTR-8/SVneo细胞;4、qRT-PCR和Western blot检测转染后细胞miR-210对NOTCH1的调节作用;5、Transwell实验模型检测细胞迁移及侵袭能力;结果1、与正常胎盘组织相比,子痫前期患者胎盘组织中miR-210的表达水平升高,而NOTCH1的表达水平降低;且在子痫前期患者的胎盘组织中,miR-210与NOTCH1在m RNA水平的表达呈现负相关关系;2、NOTCH1在绒毛及蜕膜组织中滋养细胞中均有表达,且在蜕膜组中的表达增强;3、下调NOTCH1的表达,HTR-8/SVneo细胞中NOTCH1在m RNA及蛋白水平均表达下降,同时细胞的迁移及侵袭能力减弱;4、上调miR-210的表达会减弱HTR-8/SVneo细胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同时细胞的迁移及侵袭能力均减弱;5、下调miR-210的表达会增强HTR-8/SVneo细胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同时细胞的迁移及侵袭能力均升高;若同时共转染NOTCH1沉默质粒,NOTCH1表达水平与对照组相比,几乎不受影响,且HTR-8/SVneo细胞转移和侵袭能力恢复至对照组水平;结论miR-210可减弱NOTCH1的表达,抑制滋养细胞的迁移和侵袭能力,可能是子宫螺旋动脉障碍的重要调控机制。
【图文】：

表达水平,细胞凋亡

图 1-2 qRT-PCR 检测 miR-210 的相对表达水平。过表达组 HTR-8/SVneo 细胞miR-210 的 RNA 水平显著高于阴性对照组（*：P＜0.05），而抑制组 HTR-8/SVneo细胞 miR-210 的 RNA 水平显著低于阴性对照组（***：P＜0.001）。三、miR-210 对滋养细胞生物学行为的影响①细胞增殖能力比较CCK-8 法检测 miR-210 对 HTR-8/SVneo 细胞增殖能力的影响，结果见图1-3。与 miR-210 mimic NC 组相比，miR-210 mimic 组细胞的增殖能力显著减弱（1.16±0.05 vs 0.88±0.04, p<0.01）。而与 miR-210 inhibitor NC 组相比，miR-210inhibitor 组细胞的增殖能力显著增强（0.94±0.02 vs 1.07±0.03, p<0.05）。②细胞凋亡能力比较流式细胞术检测 miR-210 对 HTR-8/SVneo 细胞凋亡能力的影响，结果见图1-3。与 miR-210 mimic NC 组相比，miR-210 mimic 组细胞的凋亡能力增强（5.52±0.16 vs 12.36±0.10, p<0.001），，Bcl-2的mRNA（1.14±0.14 vs 0.56±0.15, p<0.05）

细胞迁移,过表达,流式细胞术,细胞凋亡

图 1-3 A CCK-8 法检测细胞增殖能力。miR-210 mimic 组细胞的增殖能力显著减弱（P<0.01），而 miR-210 inhibitor 组细胞的增殖能力显著增强（P<0.05）。流式细胞术。B&C 流式细胞术检测细胞的凋亡能力。miR-210 过表达组细胞凋亡显著增加（P<0.001），而 miR-210 抑制组，细胞凋亡显著减少（P<0.01）。D-H miR-210 过表达组，Bcl-2 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.01）表达水平均降低，BAX 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.05）表达水平均升高；而 miR-210 抑制组与之相反。③迁移与侵袭能力的比较采用 Transwell 模型检测 miR-210 对 HTR-8/SVneo 细胞迁移与侵袭能力的影响。倒置光学显微镜下计数，过表达 miR-210 后，细胞迁移与侵袭数目均较阴性对照组显著减少，见图 1-4A&C。而抑制 miR-210 的表达后，细胞迁移与侵袭数目均较阴性对照组显著增多，见图 1-4A&C。进一步地，检测细胞迁移与侵袭相关因子基质金属蛋白酶-2（MMP-2）转录
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.2

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