母体孕期邻苯二甲酸二乙基己酯暴露对胎儿宫内生长的影响及其对子代神经行为发育的远期效应

发布时间：2020-05-26 15:58

【摘要】：邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是世界范围内使用最广泛的塑化剂,在环境中无处不在。DEHP是一种典型的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),具有男性生殖发育毒性,孕期DEHP暴露可引起雄性子代睾丸的发育损伤,肛门与生殖器间距离(anogenital distance,AGD)减小和血清睾酮含量降低。近年来,越来越多的研究证据表明孕期DEHP暴露与出生体重的降低有关,但人群流行病学结果尚存在争议性,并且孕期DEHP暴露的作用敏感期尚未明确,是否存在性别差异性也不得而知,潜在的胎盘机制尚未研究,为解决以上问题,我们首先研究一建立小鼠孕期DEHP暴露模型,探讨孕期DEHP暴露对仔鼠宫内生长发育的影响,并明确其致子代宫内生长受限(intrauterine growth restriction,IUGR)的敏感期;随后研究孕期DEHP暴露对小鼠胎盘甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor,THR)信号和胎盘血管生成的影响;最后,结合人群病例对照研究的结果,阐明甲状腺激素受体信号在孕期DEHP暴露致IUGR中的作用及机制。同时,孕期DEHP暴露对子代神经发育的影响也越来越受到人们的关注,研究证据表明孕期DEHP暴露损伤婴幼儿期、青春期甚至成年期子代的神经行为发育,但对老年期的神经行为是否有影响,尚不可知。为此,研究二建立小鼠孕期DEHP暴露模型,通过一系列行为学实验检测子代在老年期的神经行为表现,明确孕期DEHP暴露对子代神经行为发育的远期效应。本次研究明确了孕期DEHP暴露的发育毒性及其作用的关键期,探讨了潜在胎盘机制,并揭示了孕期DEHP对子代神经行为的远期效应。研究一母体孕期DEHP暴露致子代宫内生长受限的胎盘机制目的探讨是否孕期DEHP暴露以性别特异性的方式导致IUGR发生,明确DEHP致胎儿IUGR的关键期,探索潜在的胎盘机制。方法为探讨孕期DEHP暴露对胎儿宫内生长发育的影响,孕鼠随机分为3组:对照组,低剂量暴露组(50 mg/kg/day)和高剂量组(200 mg/kg/day),孕全程(GD0-GD17)给予DEHP灌胃处理,于GD18剖杀全部孕鼠,记录每窝吸收胎、死胎和活胎数,辨别活胎雌雄并测量体重和身长,记录胎盘重;收集母鼠血清和胎鼠血清,电化学免疫发光发检测血清甲状腺激素(thyroid hormones,THs)水平;为探讨不同孕期DEHP暴露对胎儿宫内生长发育的影响,孕鼠随机分为3组:孕早期暴露组(GD0-GD6),孕中期暴露组(GD7-GD12)和孕晚期暴露组(GD13-GD17),剂量选择为200 mg/kg/day,在不同孕期每天给予孕鼠灌胃处理。GD18剖杀孕鼠,记录每窝吸收胎、死胎和活胎数,辨别活胎雌雄,并测量活胎体重和身长;为探讨孕期DEHP暴露致子代IUGR的潜在胎盘机制,孕鼠随机分为3组,从GD0-GD14给予孕鼠DEHP灌胃处理(0,50或200 mg/kg/day),GD15剖杀孕鼠,收集母鼠血清和胎盘,部分胎盘用于总RNA提取,验证胎盘THR、营养物质转运泵和胎盘相关生长因子的基因表达水平,部分胎盘用于蛋白印迹实验,检测THR的核转位水平,部分胎盘用于组织病理学检测,HE染色比较各组胎盘迷路层血窦面积,免疫组织化学法比较各组胎盘迷路层微血管密度。人群病例对照研究以马鞍山优生优育队列为依托,免疫组织化学法比较小于胎龄儿组(small for gestational age,SGA)和适于胎龄儿组(appropriate for gestational age,AGA)胎盘微血管密度和滋养细胞甲状腺激素受体表达情况。结果孕期DEHP暴露对母鼠饲料消耗量和体重增长没有影响,孕期DEHP暴露引起仔鼠出生体重和身长显著降低,暴露组平均每窝IUGR发生率显著升高,对照组发生率为8.9%,低剂量组为28.6%,高剂量组为67.7%,呈现明显剂量-效应关系;分性别进行分析发现,DEHP处理组雄鼠体重和身长显著低于对照组,处理组雌鼠的体重和身长也显著低于对照组,不存在性别差异;在不同孕期给予母体DEHP暴露结果发现,不同孕期DEHP暴露对饲料消耗量和体重增长都没有影响。按暴露孕期进行分析发现孕早期暴露并不影响仔鼠体重,孕中期暴露稍降低仔鼠体重和身长,孕晚期暴露显著降低仔鼠体重和身长,同样也不存在性别特异性,这些结果表明孕期DEHP暴露可致子代IUGR,不存在性别特异性,孕中期和孕晚期是其作用的关键期;电化学免疫发光结果表明孕期DEHP暴露对母鼠和仔鼠血清中甲状腺激素水平没有影响;孕期DEHP暴露明显下调胎盘甲状腺激素受体Thrα1和Thrβ1基因表达,并显著抑制THRα1和THRβ1的细胞核转位;孕期DEHP暴露显著下调胎盘Pgf,Vegf和Igf等甲状腺激素受体下游基因的表达;各组之间胎盘重量没有差别,但DEHP处理组的胎盘迷路层血窦面积显著缩小,且迷路层微血管密度显著降低;胎盘物质转运泵(Glut1和Fatp1)基因的表达在DEHP处理组小鼠也是下调的;病例对照研究结果表明,SGA组胎盘微血管密度显著低于AGA组,甲状腺激素受体THRα1和THRβ1的蛋白表达丰度也显著低于AGA组。结论孕期DEHP暴露可导致子代IUGR,无性别差异性,但存在明显窗口期;孕期DEHP暴露通过干扰甲状腺激素受体信号,造成胎盘血管生成障碍,从而导致子代IUGR。研究二孕期DEHP暴露对子代体格和神经行为的远期效应目的探讨孕期DEHP暴露对子代体格发育和神经行为的远期影响。方法孕鼠随机分为3组,对照组,孕中期暴露组(GD7-GD12)和孕晚期暴露组(GD13-GD18),剂量选择为200 mg/kg/day。自然分娩后,辨别仔鼠雌雄,称量每窝所有仔鼠体重,并将窝别大小调整为10只小鼠(5只雌鼠和5只雄鼠),出生后第21天进行断乳,按照孕期处理和性别进行分笼饲养,每周记录体重;进入老年期后,进行一系列的行为学实验,旷场实验和高架十字迷宫实验检测小鼠焦虑状态,糖水偏好实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁状态,Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习和记忆功能。结果孕晚期DEHP暴露显著降低仔鼠出生体重,并观察到明显的追赶性生长,没有性别差异,断乳时,各组体重之间没有差别,成年时,各组体重之间没有差别,老年期时,各组体重之间也没有差别,表明孕期DEHP暴露对子代体格发育没有远期效应;老年期时行为学检测结果发现孕晚期而非孕中期DEHP暴露显著增加雄性小鼠的焦虑样行为,表现为旷场实验中在中央区停留时间缩短和进入中央区次数减少,高架十字迷宫实验中进入开臂次数减少和在开臂停留时间缩短;孕晚期而非孕中期DEHP暴露显著增加雄性小鼠的抑郁样行为,表现为强迫游泳实验中不动时间延长,但在糖水偏好实验中各组之间糖水偏爱指数没有差别;孕中期而非孕晚期DEHP暴露显著损伤雄鼠的空间学习和记忆功能,表现为Morris水迷宫实验中训练期逃跑潜伏期延长,测试期时穿越平台次数减少和在目标象限中总运动距离缩短;然而,孕期DEHP暴露对雌鼠的焦虑和抑郁样行为以及空间学习和记忆功能都没有影响。结论孕期DEHP暴露损伤老年小鼠神经行为,存在明显的性别依赖性和孕期特异性。总结论综合研究一和研究二的结果,得出以下3个结论:(1)孕期DEHP暴露导致胎儿宫内生长受限,无性别依赖性,存在作用敏感期;(2)孕期DEHP暴露通过干扰胎盘甲状腺激素受体信号,阻碍胎盘血管生成,从而导致胎儿宫内生长受限;(3)孕期DEHP暴露损伤老年鼠神经行为,存在明显的性别依赖性和孕期特异性。
【图文】：

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安徽医科大学博士学位论文litter, live fetuses per litter, dead fetuses per litter, total sex ratio were analyzed using one-wayANOVA followed by SNK. The result of resorptions per litter and IUGR incidence per litter wasanalyzed using nonparametric tests and average sex ratio was analyzed using chi-square test.Quantified data are represented as means ± SEM. As compared with control group, * p<0.05, **p<0.001.As compared with low-dose group, # p<0.05, ## p<0.001.

甲状腺激素水平,仔鼠,母体,血清

4.5 孕期 DEHP 暴露致 IUGR 胎盘机制的探讨4.5.1 孕期 DEHP 暴露对母体和仔鼠甲状腺激素水平的影响本研究探讨了孕期 DEHP 暴露对母体和仔鼠甲状腺激素水平的影响，采化学免疫发光法进行检测分析，结果如图 2 所示：无论是低剂量或高剂量暴露，均没有影响 GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT3的水平，GD15 和 GD18血清中 TT3的水平相近；同样，无论是低剂量或高剂量 DEHP 暴露，均没有GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT4的水平，GD15 和 GD18 母体血清中 TT4的相近；对仔鼠血清检测发现： DEHP 暴露没有引起仔鼠血清中 TT3和 TT4浓改变。有趣的是，我们发现仔鼠血清中 TT3的浓度约是 GD15 和 GD18 母体血TT3浓度的两倍。这些结果表明，孕期 DEHP 暴露对母体和胎儿血清甲状腺激平没有影响，至少在本次实验的 DEHP 暴露剂量下没有影响。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R715.3

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